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多环芳烃(PAHs)是指含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物,主要来源于有机物的热解或不完全燃烧,迄今为止已发现致癌性的PAHs及其衍生物达400多种,其中苯并(a)芘(B[α]P)是致癌性最强的PAHs。近年来,随着海上石油和轮船运输业的发展以及工业、生活污水的大量排放,海洋环境中PAHs的污染日益加重,已有研究表明我国近岸海水中PAHs最高浓度可达551.2ng·L-1,沉积物中PAHs的含量可达82-4567ng·g-1,与国外相比属中等污染水平,严重威胁着海洋环境的生态安全。栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国浅海重要的养殖贝类,近年来由于遭受大规模流行性疾病的危害,给扇贝养殖业造成了严重的经济损失。由于双壳贝类营滤食性生活,代谢率低,对PAHs等有机污染物具有较强的生物蓄积作用,已有学者提出栉孔扇贝流行性病害的爆发可能是由于污染物在扇贝体内长期积累,造成扇贝机体免疫力下降,对病原易感性增强而引起的,但关于这方面研究甚少。故本文研究了B[α]P胁迫下,栉孔扇贝血细胞活性、细胞内MAPKs通路、活性氧含量、血细胞损伤、凋亡、免疫防御指标的变化以及MAPKs通路在细胞各生理反应中的介导作用,探讨了B[α]P对栉孔扇贝血细胞的免疫毒性机制。1 B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性的影响应用台盼蓝排斥法、四甲基偶氮唑(MTT)、二甲氧唑黄(XTT)、中性红比色法以及乳酸脱氢酶(LDH)活性测定法筛选了栉孔扇贝血细胞活性的检测方法,研究了B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性的影响。结果表明96孔培养板中栉孔扇贝血细胞接种密度在1-32×104 cell/孔时,血细胞活性无显著性差异(p>0.05),且细胞存活率在97.42-98.82%之间,台盼蓝排斥法、MTT、XTT比色法、LDH活性测定法均可作为栉孔扇贝血细胞活性的测定方法,而当血细胞接种密度在12-32×104 cell/孔时,中性红比色法亦可作为血细胞活性的检测方法;同时实验采用Eagle培养液进行血细胞原代培养在0-24h内血细胞活性较好。采用中性红比色法检测出B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性具有显著抑制作用,且抑制程度与B[α]P作用浓度、时间呈正相关,其余方法均未检测出B[α]P对血细胞活性的影响。由此可见,B[α]P对栉孔扇贝血细胞活性具有免疫毒性作用,中性红比色法可以作为评价B[α]P对栉孔扇贝血细胞免疫活性的敏感指标。2 B[α]P对栉孔扇贝血细胞MAPKs信号通路表达和免疫毒性效应的研究本实验研究了B[α]P对栉孔扇贝血细胞MAPKs信号通路、ROS含量、溶酶体膜稳定性、血细胞骨架、DNA损伤、血细胞凋亡以及吞噬、溶菌、抗菌活力的影响。结果表明实验时间内B[α]P对各指标影响显著(P<0.05),而对照组各指标均无显著变化(P>0.05)。B[α]P胁迫显著激活了MAPKs通路,其中ERK、JNK的激活呈峰值变化,均在12h时磷酸化水平达到最高值,而p38通路的激活显著早于ERK和JNK通路的激活,并且和B[α]P胁迫浓度、作用时间正相关;实验期间,血细胞中ROS含量、溶酶体膜、细胞骨架、DNA损伤以及血细胞凋亡呈上升趋势,并且和B[α]P胁迫浓度正相关,并且血细胞的凋亡主要发生在凋亡早期,晚期凋亡细胞较少;而栉孔扇贝血细胞吞噬、溶菌、抗菌活性在B[α]P胁迫显著降低;降低程度和B[α]P胁迫浓度正相关。实验结果表明实验时间内血细胞内ROS的产生、细胞损伤、细胞凋亡以及血细胞吞噬、溶菌、抗菌活力的变化趋势具有较好相关性,故作者认为在B[α]P胁迫下ROS的上升是诱导血细胞损伤、凋亡的重要原因之一,而血细胞的损伤则是诱导栉孔扇贝血细胞免疫防御能力下降的重要原因,同时作者推测MAPKs信号通路的激活介导了B[α]P胁迫下血细胞的各种生理反应。3栉孔扇贝血细胞在B[α]P胁迫下MAPKs通路免疫介导机制的研究本实验研究了MAPKs信号通路在B[α]P诱导栉孔扇贝血细胞免疫毒性中的介导作用,实验结果表明,MAPKs特异性抑制剂能有效抑制B[α]P对栉孔扇贝血细胞MAPKs的激活,并且MAPKs亚族在B[α]P诱导的栉孔扇贝血细胞ROS产生,血细胞损伤、凋亡以及免疫防御能力变化过程中发挥着重要调节作用。ERK、p38通路的激活能诱导ROS的上升,而JNK对此无诱导作用;在溶酶体膜损伤中,ERK、p38通路分别起到降低、增加溶酶体膜损伤的作用,而JNK对此亦无调节作用;在细胞骨架损伤过程中,ERK的激活起降低损伤的作用,而p38和JNK通路的活化则起相反作用;在DNA损伤过程中,JNK通路不参与此过程,而ERK、p38的激活在此过程中起到了正调节作用;ERK、p38和JNK三条通路在细胞凋亡中均发挥作用,前者的激活能阻止凋亡的发生,而后两者的活化能促进细胞凋亡的发生;在B[α]P诱导的免疫调节过程中,ERK的活化能增强血细胞的吞噬、溶菌、抗菌活力,而p38通路的活化则与ERK通路的作用相反,JNK的激活能抑制血细胞的吞噬活力,而对溶菌、抗菌活力无介导作用。由此可见,MAPKs信号通路对细胞不同生理反应的介导作用不同,或起正调节作用,或起负调节作用。综合其效应,MAPKs的激活除对溶酶体膜损伤的正调节和负调节程度相当外,对B[a]P胁迫下栉孔扇贝血细胞活性氧上升、DNA损伤、血细胞凋亡、细胞免疫防御能力下降反应都是起促进作用,故作者认为B[a]P胁迫下,MAPKs的激活通过调节机体各种生理反应最终导致了栉孔扇贝免疫防御能力的降低。