背景与目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)可引起慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等上消化道疾病,并与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生有关。现阶段临床治疗Hp感染中存在患者依顺性差、费用昂贵及日趋严重的细菌耐药性等问题。大量实验证明,Hp疫苗能有效地预防Hp感染。目前研究中的Hp疫苗基本都属于预防性疫苗。然而,对Hp感染人群还需要进一步研制安全有效的治疗性Hp疫苗。动物实验研究发现,以Hp全菌抗原为基础的疫苗对Hp感染有一定的治疗效果。因此,本研究对Hp灭活全菌治疗性疫苗进行初步研究,摸索灭活全菌的制备,筛选佐剂、免疫剂量、免疫途径及免疫周期,观察免疫治疗效果及对Hp再次感染的抵抗力,初步探索Hp治疗性疫苗免疫清除机制。实验设计:1. 疫苗抗原制备:通过对接种量和产量定量,优化液体培养Hp条件,福尔马林灭活Hp全菌并检定其质量。2. 佐剂选择:分别以CT、LT、CpG为粘膜佐剂口服免疫,以弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂和CpG注射免疫Hp感染沙鼠模型,观察治疗效果。3. 免疫剂量、免疫途径、免疫周期的确定:用灭活Hp全菌加氢氧化铝佐剂(以下简称“Hp治疗性疫苗”)注射免疫Hp感染沙鼠模型,选择最佳注射免疫途径、免疫剂量、免疫周期。4. Hp治疗性疫苗免疫治疗效果、免疫记忆性观察:Hp治疗性疫苗注射免疫Hp感染沙鼠模型,末次免疫后1月再次用同一菌株感染,观察治疗效果及抵抗再感染的作用。5. 免疫清除机制探索:RT-PCR检测疫苗免疫后沙鼠胃粘膜的INF-γ、IL-4及IL-12p40表达量的相对差异;Hp治疗性疫苗用同样方法免疫BALB/c小鼠,ELISA检测不同时间Hp特异性血清IgG、IgA和唾液sIgA水平的变化。研究结果:1. 液体培养Hp接种菌量以106/ml为宜,培养27小时最佳;1:2000福尔马林25℃下灭活1×109CFU/ml Hp全菌14小时,灭活完全,镜下观察其形态无变化,抗原性好,<WP=9>4℃可保存12个月以上。2. 灭活Hp全菌加氢氧化铝佐剂注射对沙鼠胃内Hp清除率较高,达93.3%。3. 抗原以1×108CFU菌量为宜;0、1、2、3周免疫周期效果好。4. Hp治疗性疫苗对沙鼠胃内Hp清除率达93.3%,对再次攻毒的保护率达90.0%。5. 疫苗免疫后沙鼠胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40表达量均增加;BALB/c小鼠末次免疫后3周开始,特异性血清IgG、IgA和唾液sIgA水平均显著升高。结论:本研究优化了Hp培养及福尔马林灭活条件,筛选了Hp治疗性疫苗的佐剂和免疫方案。Hp治疗性疫苗注射免疫Hp感染的沙鼠,能够产生良好的免疫应答并能有效清除Hp感染,而且对Hp再次攻毒有很好的免疫保护作用。沙鼠胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40表达量的改变,提示该疫苗的作用机制是诱导Th1/Th2平衡型免疫应答,免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示该疫苗诱导Hp特异性血清IgG、IgA和sIgA水平均升高。本试验为研究Hp治疗性疫苗提供了重要实验依据。