背景癫痫(Epilepsy, EP)是一组由多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所引起的以短暂中枢神经系统功能失常为特征的综合征。在21世纪初,全球共有大约5000万的癫痫患者,其中4200万为活动性癫痫的患者,他们中有82%生活在欠发达的地区。癫痫的患病率各国不一,总体而言,发达国家相对偏低,而发展中国家偏高。我国将近有900万癫痫患者,症状性癫痫占多数,且每年新增癫痫病人40万左右。而50%或更多的患者却未能得到正常的医治,使患者的病情反复发作而严重影响患者的生活质量,因此对癫痫的治疗是一项十分艰巨而又十分重要的任务。目前控制癫痫仍以抗癫痫化学药物(antiepileptic drugs, AEDs)为主,常用一线抗癫痫药如苯妥英、丙戊酸、卡马西平等可使70%-80%的癫痫患者发作得以控制,但这些药物药代动力学的局限性及耐受性、致畸的可能性、严重皮疹、对肝脏的毒副作用,及易对认知功能产生的严重不良作用而导致癫痫患者生活质量下降等因素,限制了其应用。新型抗癫痫药物,如加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、左乙拉西坦等,患者对其耐受性较传统抗癫痫药物大大降低。但新型AEDs的不良反应事件也被频频报道,且其费用较一线AEDs昂贵,因此,目前临床应用也受到限制。如果药物疗法不能成功控制癫痫,可以尝试手术治疗、迷走神经刺激术和酮食疗法。但大约25%～30%左右的癫痫患者对各种疗法包括药物、癫痫手术、迷走神经刺激术等耐受,这就需要研发新的抗癫痫药物或发展新的治疗方法。二十五味珊瑚丸是传统藏药,具有清热定惊、开窍通络、活血止痛等功效,用于治疗“白脉病”,症见神志不清、身体麻木、头晕目眩、脑部疼痛、血压不调、头痛、癫痫及各种神经性疼痛。黄福开教授多年的临床床经验认为：本品结合AEDs治疗症状性癫痫特别对难治性部分性癫痫及脑梗后继发的癫痫效果显著,本品既可以提高AEDs的抗癫痫效果又可降低AEDs的不良作用发生率及其发生的严重程度。本课题组对该药治疗症状性癫痫的临床疗效进行回顾性评价,为下一步的动物实验提供证据支持。由于临床上运用本品抗癫痫治疗时往往添加AEDs,所以该药单药抗癫痫的效能如何,适用于何种癫痫发作类型及其通过何种机制起到抗癫痫的作用,目前的研究仍处于空白状态。戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)急性惊厥模型及最大电休克发作(maximal electroshock seizure, MES)模型是目前使用最多的急性致痫模型。既往研究表明能抑制动物PTZ急性惊厥发作的药物,临床上对失神发作及阵挛性发作有效；能抑制MES模型发作的药物,临床上对全面强直-痉挛性发作有效。总之,能抑制上述两种动物模型惊厥发作的药物,具有一定的抗癫痫及抗惊厥的作用。本实验在回顾性临床研究的基础上,初步观察与比较二十五味珊瑚丸单药对以上两种不同急性致痫动物模型的效应。由于时间的关系,目前研究尚未深入到慢性癫痫动物模型的研究及本品抗癫痫的分子作用机制的研究。目的评价AEDs添加二十五味珊瑚丸治疗症状性癫痫的疗效,及其对癫痫反复发作所致或长期药物疗法所致的认知障碍与癫痫发作后头痛的影响,为“二十五味珊瑚丸既可以辅助AEDs提高抗癫痫疗效又可以降低AEDs的不良反应”提供证据支持,为抗癫痫临床用药方案提供新的思路和方法。研究二十五味珊瑚丸单药对急性致痫动物的发作行为、脑电、痛阀、自发活动的影响,为“二十五味珊瑚丸单药具有抗癫痫、抗惊厥的作用”、“具有中枢性的镇痛作用”及“具有镇静的作用”提供证据支持,为本品的抗癫痫机制的研究及即将进行的前瞻性临床试验探路。1、观察添加二十五味珊瑚丸治疗症状性癫痫能否显著减少癫痫发作频率与发作持续时间；2、观察添加二十五味珊瑚丸治疗症状性癫痫能否显著抑制痫性放电；3、观察添加二十五味珊瑚丸治疗能否显著减轻癫痫发作后头痛程度；4、观察添加二十五味珊瑚丸治疗能否改善认知功能障碍；5、通过急性致痫动物模型实验,研究二十五味珊瑚丸单药是否具有抗癫痫及抗惊厥的作用；6、通过热板及热辐射甩尾镇痛试验,研究二十五味珊瑚丸是否具有中枢性镇痛作用。7、通过比较干预前、后小鼠自主活动次数的变化情况,研究二十五味珊瑚丸是否具有镇静的作用。方法与内容一、回顾性临床研究方法与内容1.1研究对象于2009年7月～2010年10月在北京藏医院癫痫科门诊诊治的患者。纳入标准：(1)符合国际抗癫痫联盟(ILAE)推荐的癫痫和癫痫综合征的分类(1989)方案诊断症状性癫痫的标准；(2)病历资料记载完整；(3)添加治疗前与添加治疗后所用AEDs种类一致。排除标准：(1)病史不详、病历记载或临床常规检查项目不全面者；(2)有癫痫家族史的患者；(3)因为各种原因不能连续治疗者；(4)添加治疗前与添加治疗后所用AEDs种类不一致者。具备上述4条标准中任何1条即不能入选。1.2临床资料的收集回顾性分析病历,按照纳入和排除标准,设计临床病例报告表,收集到176例症状性癫痫患者的临床资料。三组二十五味珊瑚丸添加组,所采用的AEDs分别是卡马西平、丙戊酸、希力舒,对照组采用丙戊酸添加顺气安神丸治疗,疗程均为1年。录入数据,统计各组添加治疗前、后癫痫发作频率,发作类型,发作持续时间,动态脑电图(AEEG)的异常程度,认知障碍程度,头痛程度,不良作用发生率及发生程度。1.3疗效及安全性评定标准疗效评定标准：参照“癫痫发作分类及药物临床疗效评定全国试行草案”分：(1)基本控制：一年内不发作；(2)显效：发作频率减少75%以上；(3)有效：发作频率减少50%～75%；(4)改善：发作频率减少25%～50%；(5)无效：发作频率减少25%以下。安全性评定标准：以不良作用发生率及发生的严重程度来评价药物的安全性。1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件包进行统计。组内添加前、后的比较采用配对t检验法；计数资料采用pearson卡方检验；等级资料采用Kruskal-WallisH检验；计量资料采用单向方差分析,考虑其他协变量的影响,采用协方差分析验证；各组添加治疗后动态脑电图异常程度采用等级Logistic回归分析；添加治疗后的不良反应结果采用二分类的Logistic回归分析,P<0.05为差异有统计学意义。由南方医科大学统计教研室陈平雁教授协助完成统计分析。二、动物实验研究方法与内容2.1急性致癫动物模型研究2.1.1PTZ急性致痫大鼠造模及处理60只wistar雄性大鼠,随机分为6组。各组大鼠均在造模前灌胃给药,A组给予等容积去离子水,B、C、D组分别按照100mg/(kg.d)、200mg/(kg.d)、400mg/(kg.d)灌胃给予二十五味珊瑚丸混悬液,E组按200mg/(kg.d)给予VPA混悬液,F组先按照200mg/(kg·d)给予VPA混悬液后,8h后再按照100mg/(kg·d)灌予二十五味珊瑚丸混悬液,连续干预7天,早晚各一次,末次给药1h后腹腔注射PTZ溶液(50mg/kg),立即观察大鼠的行为学变化30mins,记录发作性阵挛的潜伏期、发作持续时间、发作后恢复探索所需时间、发作性阵挛次数以及大鼠发作级别的例数。2.1.2电极的埋植及脑电图的记录18只wistar大鼠,随机分为6组。各组大鼠均在造模前灌胃给药(给药方法及剂量同前),连续干预7天,早晚各一次。灌胃第3天,各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛0.35ml/100g予以麻醉后,于大鼠海马区和皮质额叶区安装不锈钢电极,并以牙科水泥固定。第7天,灌胃前先采用十六道生理信号采集系统描记脑电图10mins,各组灌药后1h腹腔注射PTZ50mg/kg,立刻观察各组大鼠脑电波幅及频率的变化30mins。2.1.3最大电休克发作模型小鼠的造模及处理利用生物物学信息采集处理系统筛选符合要求的小鼠,齿状夹以生理盐水浸润后,夹住小鼠两耳尖部,进行交流电刺激,参数设定为44v,0.3s,单次刺激,以后肢强直性伸直为惊厥指标,筛选符合条件的昆明种雌性小鼠60只,随机分为6组,A组给予等容积去离子水,B、C、D组分别按照200mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、800mg/(kg·d)灌予二十五味珊瑚丸混悬液,E组按400mg/(kg·d)给予丙戊酸钠混悬液,F组先按照400mg/(kg·d)给予丙戊酸钠混悬液,8h后再按照200mg/(kg·d)灌予二十五味珊瑚丸混悬液,连续干预7天,早晚各一次。在末次给药1h后再行上述电刺激,记录其惊厥数,计算惊厥率。2.2镇痛试验2.2.1大鼠辐射热甩尾法辐射热甩尾试验主要是用于测量大、小鼠尾巴部受红外热刺激的痛觉阈值,是中枢性镇痛试验常用的方法之一。60只wistar大鼠,分组同癫痫实验,PTZ急性致痫后,停止灌胃,静养7天后,先用甩尾痛觉测试仪测试各组大鼠的基础痛阀值,选取痛阀为5s左右的大鼠供实验用,小于3s或大于20s,表示动物反应过敏或迟钝,舍弃不用。基础痛阀值测试完后,各组大鼠继续静养7天后,按各组的给药剂量灌胃给药,分别于给药后0.5h、1h、2h测定痛阀值。测试中,若照射超过20s仍不甩尾,即中断照射,以免局部烫伤,并以20s计。2.2.2小鼠热板法60只昆明种雌性小鼠,分为6组(分组及灌药剂量同最大电休克发作实验),给药前先将热盘测试仪,调致温度为55.5℃,以小鼠舔后足为疼痛反应指标,测定小鼠的基础痛阀值,选择基础痛阀值在5s～30s之内的小鼠。测试完基础痛阀值的各组小鼠,静养7天,7天后各组分别灌胃给药,分别于给药后0.5h、1h、2h测定痛阀值,测试中若超过30s仍不添后足,即刻取出以避免烫伤,并以30s计。2.3镇静试验最大电休克发作后的60只昆明种雌性小鼠,静养7天,灌胃前先用小鼠自主活动记录仪测定每只编号小鼠5mins内自发活动的次数作为基础活动次数值。各组于基础活动次数值测试完的第2天的同一时间点按照各组药物剂量灌胃给药,于给药后1h,测定各组小鼠5mins内的自发活动次数。2.4统计学方法数据应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(one-way ANOVA检验),考虑其他协变量的影响时,采用协方差分析验证。计数资料采用卡方检验,χ2值选用pearson法检验。组内干预前、后的比较采用配对t检验法。结果一、临床研究结果1.1总共收集到176例症状性癫痫患者,平均年龄(26.2±10.0)岁,男性较女性多(男：女=2：1),除发作年龄的比较有统计学意义(F=2.863,P=0.038)外,其他基线指标的比较均无统计学差异(P>0.05),表明四组间均衡性较好。1.2各组添加治疗后与添加前比较,均具有减少癫痫发作次数,缩短癫痫发作持续时间的作用(P<0.05)。1.3三组二十五味珊瑚丸添加组与顺气安神丸添加组(对照组)比较,均可以显著降低癫痫发作次数下降率与癫痫发作时间下降率(P<0.05)；但三组治疗组之间比较无统计学差异(P>0.05)。1.4各组添加治疗后与添加治疗前比较,均可以显著抑制痫性放电(P<0.05)与顺气安神丸添加组比较,三组二十五味珊瑚丸添加组均具有减轻AEEG的异常放电程度的作用(P<0.001),但三组观察组之间比较无统计学差异(P>0.05)。1.5三组观察组添加后与添加前比较,均可以显著减轻癫痫发作后头痛程度及认知障碍程度(P<0.001),但三组之间的比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组添加后与添加前比较,头痛与认知障碍程度的改善差异无统计学意义(P>0.05)。1.6各组添加组的不良作用发生率和发生的严重程度与常规西药单药组比较均有统计学差异(P<0.05),AEDs添加二十五味珊瑚丸或顺气安神丸治疗后,AEDs的不良作用程度及不良作用发生率均显著降低,但四组添加组之间的比较差异无统计学意义(p>0.05)。二、动物实验研究结果2.1急性PTZ致痫大鼠模型研究结果显示：与对照组比较,二十五味珊瑚丸中、高剂量组,丙戊酸钠组及联合用药组均具有延长大鼠发作性阵挛潜伏期的作用(P<0.05)；二十五味珊瑚丸低剂量组的发作性阵挛潜伏期在均数上优于对照组,但比较无统计学差异(P>0.05)。2.2五组处理组PTZ急性致痫后,大鼠的发作行为(发作持续时间、发作性阵挛的次数、发作级别)与对照组比较均有统计学意义(P<0.05),但五组处理组之间的比较无统计学差异。2.3从均数上观察发现,与对照组比较,五组处理组均具有缩短PTZ急性致痫大鼠痫性发作后恢复探索所需时间的作用,但只有二十五味珊瑚丸中剂量组、高剂量组及联合用药组与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。2.4模型组大鼠的脑电图阵发性出现大量高幅的尖波、棘波、棘慢复合波及尖慢综合波；二十五味珊瑚丸高剂量组、联合用药组及丙戊酸钠组的痫性放电明显受到抑制,偶见少量棘波或尖波,波幅不高；二十五味珊瑚丸中剂量组可见散在的棘波或尖波,但波幅较低,无棘慢或尖慢复合波；二十五味珊瑚丸低剂量组出现较多棘波、尖波和少量的棘慢复合波,波幅较高,但低于模型组。2.5与对照组比较,五组处理组均具有降低MES小鼠惊厥率的作用(P<0.05),从均数上看,以联合用药组的抗惊厥作用最显著,丙戊酸钠组次之,然后是二十五味珊瑚丸高、中剂量组,低剂量组最差。2.6热板及辐射热甩尾镇痛试验的研究结果显示：二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组与对照组比较,均具有提高动物痛阀的作用(P<0.05),其中中剂量组的镇痛作用起效最快,低剂量组次之,高剂量组的镇痛起效缓慢,但作用较持久。2.7小鼠自主活动试验的研究结果显示：五个处理组与对照组比较,均具有显著减少小鼠自主活动次数的作用(P<0.05)。从均数上看,以丙戊酸钠的镇静效果最显著,联合用药组次之,然后分别是二十五味珊瑚丸中、高、低剂量组。结论1、临床试验研究结论三种二十五味珊瑚丸配伍方案(三组二十五味珊瑚丸添加组)对症状性癫痫皆具有显著降低癫痫的发作频率,减轻痫性放电程度,改善癫痫发作后头痛及认知功能障碍程度的作用；其中二十五味珊瑚丸联合丙戊酸钠组和联合希力舒组均具有改善癫痫发作类型的作用；联合希力舒组还可以显著缩短癫痫发作持续时间。综合以上研究结果,推测希力舒添加二十五味珊瑚丸治疗症状性癫痫可能得到更佳的综合性改善效果。2、动物实验研究结论二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组对PTZ急性致痫大鼠均具有抗癫痫的作用；对MES惊厥小鼠均具有抗惊厥的作用。二十五味珊瑚丸中、高剂量组的痫性发作后恢复探索时间、发作性阵挛次数及痫性放电情况皆优于丙戊酸钠组。丙戊酸钠组的大鼠发作性阵挛潜伏期长于(优于)二十五味珊瑚丸组,但比较无统计学差异。从MES模型小鼠的惊厥率看,丙戊酸钠组优于二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组,联合用药组优于丙戊酸钠组。综合以上研究结论,本课题组推测二十五味珊瑚丸对临床上失神发作及阵挛性发作可能优于丙戊酸钠,对全身强直-痉挛性发作可能不及丙戊酸钠。二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组均具有中枢性镇痛作用,且其镇痛效果显著优于丙戊酸钠组,本研究结果进一步为“添加该药治疗癫痫可以缓解癫痫发作后头痛及肌肉痛”提供证据支持。二十五味珊瑚丸低、中、高剂量组均具有镇静的作用。本品的镇静效果不如丙戊酸钠,但丙戊酸钠组动物易出现深度镇静现象,如嗜睡、乏力、淡漠等。综上所述,本课题研究分为临床和基础两部分。临床部分采用了回顾性分析病历的方法对二十五味珊瑚丸添加治疗症状性癫痫的临床疗效和安全性进行评价；动物实验研究部分运用急性致痫动物模型,研究二十五味珊瑚丸单药对急性致痫动物的脑电、发作行为、痛阀、自主活动的影响。本研究发现：lAEDs添加二十五味珊瑚丸治疗症状性癫痫既可辅助AEDs提高其抗癫痫的疗效,又可降低AEDs的不良反应发生率和发生的严重程度；2.二十五味珊瑚丸添加治疗具有减轻甚至治愈癫痫所引发头痛的作用；3.二十五珊瑚丸添加治疗具有改善认知障碍的作用；4.二十五味珊瑚丸单药具有抗癫痫、抗惊厥、镇痛及镇静的作用,具有减少深度镇静,如淡漠、乏力、嗜睡等发生的作用。