论文部分内容阅读
背景原钙粘蛋白(protocadherins, Pcdhs)是一种带有同种抗原粘附活性的跨膜蛋白,主要在中枢神经系统中表达。已有研究表明,Pcdhs对神经元突触的发育有直接的影响,它不仅可以作为粘附分子加强神经突触的连接,还可以作为受体在信号转导过程中起到一定的作用。目前,已有的研究表明,一些pcdh基因的突变与人类疾病联系密切,虽然人们对Pcdhs的功能有了一定的了解,但对其作用机制仍然不是十分清楚。由于没有商业化的Pcdhs的抗体,限制了对它们研究的进一步深入。本实验旨在建立快速制备Pcdhs多克隆抗体的方法,为人们深入了解Pcdhs在发育过程中的表达情况及作用机制奠定基础,也可能为临床上相关疾病的检测提供帮助。目的建立Pcdhs多克隆抗体的制备方法以及制备Pcdh1、8和17的多克隆抗体。方法1.目的片段的扩增(1)用Globplot2.3分析Pcdh1、8、17的跨膜区,用DNAstar软件设计扩增它们的膜内和膜外区编码基因部分片段的引物。(2)以孵育7天的鸡胚脑组织(E7)中提取的总RNA为模板,通过RT (Reverse Transcription)合成cDNA,以此cDNA为模板分别扩增Pcdh1、8和17膜内和膜外区编码基因的部分片段(扩增得到的Pcdh1、8、17的膜内和膜外区编码基因的靶片段分别命名为101、102、801、802、1701和1702,本实验选取101、802、1701和1702四个基因片段进行研究)。2.原核表达载体的构建将101、802、1701和1702分别克隆至原核表达载体pGEX-2TK或pET-32a中,构建重组表达载体pGEX-2TK-101、pGEX-2TK-802、pGEX-2TK-1701和pET-32a-1702,对重组表达载体进行双酶切和测序鉴定。3.目的蛋白的诱导和纯化(1)将各重组质粒分别转入E.coli BL21中,用IPTG诱导表达GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702融合蛋白。(2)分别利用Glutathione-sepharose4B亲和层析树脂纯化3ST-101、 GST802和GST-1701融合蛋白及利用Ni-NTA Sefinose Resin亲和层析树脂纯化(His)6-1702融合蛋白。4.免疫大鼠将纯化后的GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702融合蛋白与弗氏完全佐剂混合作为抗原通过脚垫注射免疫大鼠,提取血清。5.多克隆抗体的鉴定用ELISA和Western blotting分别鉴定多克隆抗体的效价和特异性。6.检钡pcdh1、8、17的体内表达水平以GAPDH为内参,通过RT-PCR检测pcdh1、8、17的体内表达水平。结果1.成功克隆了鸡Pcdh1、17的膜内区及Pcdh8、17的膜外区编码基因的部分片段。2.成功构建了101、802、1701和1702目的基因片段的融合表达载体pGEX-2TK-101、pGEX-2TK-802、pGEX-2TK-1701和IpET-32a-1702。3.在E.coli BL21中,经IPTG诱导表达出可溶性的GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702融合蛋白,并成功纯化。4.经足垫注射免疫大鼠后,获得抗GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702的多克隆抗体。5.ELISA结果显示抗GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702抗体(抗血清)的最佳稀释比例分别1：3000、1：1600、1：800和1：3200。6.Western blotting结果显示制备的抗GST-101、GST-802、GST-1701和(His)6-1702抗体不仅能与最初免疫动物用的抗原发生特异性反应,而且能与鸡胚脑组织和脊髓中表达的Pcdh1、Pcdh8和Pcdh17蛋白发生特异性反应。7.从分子水平上检测了pcdh1、8、17在鸡胚发育过程中部分时期的体内表达情况。结论本研究建立了鸡Pcdhs多克隆抗体的制备方法,并成功制备出了鸡Pcdhl、8和17的多克隆抗体。ELISA和Western Blotting结果显示制备的多抗可以与鸡胚脑组织和脊髓中表达的Pcdh1、8和17发生特异性发应,说明这些抗体可用于鸡Pcdh1、8和17体内表达情况的检测,这为人们深入了解鸡Pcdhs在神经发育过程中的表达情况及作用机制奠定了基础。