肺泡微石症(Pulmonary alveolar microlithiasis,PAM)是一种罕见的缓慢进展的肺部疾病。特征是中下肺野肺泡内出现广泛球形钙化灶(磷酸钙盐或称为微结石)的聚集。大多数病人在诊断时是无症状的,通常是在常规体检过程中偶然发现疾病的存在,症状主要表现为反复的咳嗽或渐进性呼吸困难。疾病的发生可以是散发的也可以是家族性的,PAM有大约为38-61%是家族性发病的,属于常染色体隐性遗传病。随着分子生物学技术的迅速发展,关于其病因的研究已经取得了显著进展,目前认为肺泡上皮内是编码Ⅱb型磷酸钠协同转运蛋白(NaPi-Ⅱb)的SLC34A2基因((solute carrie family34member2,溶质转运蛋白家族34成员2)突变引起富含磷酸钙的微结石在肺泡内形成和聚集,是本病发生的主要原因。SLC34A2属于溶质转运蛋白家族SLC34的成员之一,在人体内多种组织器官均有表达。对于维持体内无机磷的代谢平衡起着至关重要的作用。在临床工作中,我们发现了一个近亲婚配的PAM家系,该家系共有4名患者,他们是同胞。本文主要对这个PAM家系进行临床特征分析、致病基因检测,从而为PAM的发病机制、遗传学特点及治疗策略的研究提供研究帮助。本研究对象为中国吉林省松原市一个典型的肺泡微石症家系。该家系为近亲结婚家庭,共有3代12人,本家系第一代为亲表兄妹近亲结婚,均健在,第二代直系子女4人,3男1女,根据其典型的影像学变化及病理改变,诊断为PAM死亡2人,第三代3人,第一代及第三代行常规胸片检查均未见发病。该家系具有明显的家族聚集性和遗传稳定性,是研究PAM致病基因理想的家系。材料和方法：本研究第一部分详细收集该家系4名患者临床资料,对于其临床特点进行分析、总结。第二部分对该家系所能联系到的9位家庭成员在严格无菌操作下采外周血5m1,另选取10例体检健康的无关正常人外周血作为对照,SLC34A2基因位于4号常染色体的短臂上,在人体位于4p15.1-p15.3,有13个外显子,第1个为非编码外显子,其余为编码外显子,针对所有编码外显子设计引物进行PCR扩增。扩增片段包括外显子及5’和3’两侧的部分内含子序列。将PCR扩增产物交由北京华大基因有限公司进行测序,测序结果用BioEdit Sequence Alignment Editor I阅读,在NCBI上进行BLAST比对。第三部分利用在CT引导下经皮肺穿刺活检获得的其中一名患者的肺组织标本与正常肺组织标本的对比,进行SLC34A2基因的功能研究。首先构建SLC34A2基因真核表达载体,利用限制性内切酶KpnⅠ和Not Ⅰ将SLC34A2基因插入到质粒载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经酶切鉴定及重组质粒核苷酸测序分析,证实pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组质粒构建成功。因SLC34A2基因编码的Ⅱb型磷酸钠协同转运蛋白(NaPi-Ⅱb),主要是在肺泡表面活性物质代谢过程中参与磷酸盐的转运,因而选取了可以模拟正常Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌肺表面活性物质的人肺腺癌细胞系A549细胞进行转染研究SLC34A2基因对无机磷代谢的影响,通过Lipofectamine2000阳离子脂质体包裹pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组表达载体转染入A549细胞进行表达,提取RNA、对重组质粒进行RT-PCR鉴定,正常对照组和PAM组均在2000bp左右的位置出现基因扩增片段,与SLC34A2预期片段大小相符,证实了pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组表达载体在A549细胞中得到完整表达。于成功转染48小时以后,收集细胞培养上清,利用全自动生化分析仪检测质粒对照组、正常对照组、PAM组细胞培养上清中无机磷浓度。结果本研究一共在2个外显子上发现了3处碱基改变。第1个是在对6号外显子PCR扩增产物测序时在3名患者中均发现了(c.575C>A)纯合突变,从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸(p.T192K),属于氨基酸替换。而在患者父母和子女的标本中该位点测序结果均为杂合突变,患者的配偶和10名正常人的测序结果均正常,属于表型-基因型共分离突变。第2个碱基改变是在对13号外显子PCR扩增产物测序时在全部家庭成员(患者及其父母、子女、配偶)和一名健康受试者中均发现的c.1901A>G纯合SNP,在NCBI的SNP数据库中查到为rs6448389。本家系所有家庭成员及1名健康受试者均有c.1901A>G,并未表现出表型-基因型共分离。第3个碱基改变同样发生在13号外显子上,是在患者及其父母还有其中1名子女的标本中发现的c.1962G>A纯合突变,在另外2名子女中为杂合突变,患者的配偶和正常人测序结果均正常。该突变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列和功能,属于同义突变；且该突变在家系中的作用同样未表现出表型-基因型共分离。在对质粒对照组、正常对照组、PAM组细胞培养上清中无机磷浓度的检测中,结果显示正常对照组细胞上清中无机磷的浓度明显下降,分别与质粒对照组(P<0.01)和PAM组(P<0.01)相比,差异均有显著性。PAM组细胞上清中无机磷的浓度略有下降,与质粒对照组(P<0.01)相比,差异均有显著性。结果证实了第一步实验中由于SLC34A2基因6号外显子的c.575C>A纯合突变,使原来编码的苏氨酸变为赖氨酸,导致NaPi-Ⅱb功能下降。结论该家系为一典型的常染色体隐性遗传肺泡微石症家系,隐匿起病,主要是在行常规胸部X线检查时发现存在PAM。根据基因测序研究发现SLC34A2基因6号外显子存在(c.575C>A)纯合突变,从而使编码的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸(p.T192K),属于表型-基因型共分离突变,也符合该家系的遗传特点,故认为是本PAM家系致病的遗传学基础。通过构建SLC34A2基因的真核表达载体,并转染人肺泡上皮细胞中,对SLC34A2基因的功能进行研究发现由于6号外显子(c.575C>A)纯合突变的发生,导致该家系PAM患者体内由SLC34A2基因编码的NaPi-Ⅱb蛋白功能下降,使其正常的磷酸盐转运功能受损,因而不能完全的从肺泡腔内清理掉磷离子,使磷酸盐在肺泡内大量沉积,与钙离子结合形成磷酸钙(微结石),导致了疾病的发生。