目的:自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis,AIT）是一种慢性器官特异性自身免疫病,主要由遗传、环境和免疫因素共同作用引起,主要亚型为桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis,HT）。HT主要血清学表现为甲状腺自身抗体（TPOAb/TgAb）水平增高,病理特征为甲状腺组织中淋巴细胞浸润伴有滤泡结构破坏。甲状腺组织内细胞种类繁多,存在免疫细胞稳态失衡,然而具体发病机制尚不明确。因此我们利用10X Genomics单细胞测序技术在单个细胞水平进行高通量转录组测序探索HT患者甲状腺组织免疫微环境,并依据单个细胞所表达的特异性标志基因进行细胞分群,并进一步比较HT患者与对照者之间基因各个亚群基因表达差异以及各个亚群之间细胞信号交流。NOD.H-2^h4小鼠是自发性自身免疫性甲状腺炎（Spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT）经典的动物模型,高碘喂养情况下,小鼠甲状腺组织免疫病理类型与桥本甲状腺炎相似,并伴血清中抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）滴度升高。炎症小体（Inflammasomes）是一种由模式识别受体（NOD样家族受体（NOD-likereceptors,NLRs）或者AIM2家族受体（Abscent in melanoma 2（AIM2）-like receptor,ALRs））、前半胱天冬酶1（Pro-caspase-1）、凋亡相关点状蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD,ASC）组成的蛋白复合体,可以识别各种外源性病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns,PAMPs）、内源性损伤相关分子模式（Danger associated molecular patterns,DAMPs）以及稳态改变分子模式（Homeostasis-altering molecular processes,HAMPs）。本实验组已经发现桥本甲状腺炎患者甲状腺组织中炎症小体（NLRP3、AIM2、NLRP1、NLRC4）及其通路分子（Caspase-1、IL-18、IL-1β）表达量高于健康对照人群。目前尚无HT患者甲状腺组织中单细胞水平转录组测序以及炎症小体在SAT动物模型方面的研究。本研究对HT患者进行10X Genomics单细胞转录组测序。动物实验中,研究NOD.H-2h4小鼠不同实验时点炎症小体及其相关通路动态变化以及Th1（T helper 1 cell）、Th17（T helper 17 cell）、Tfh（T follicular helper cells）、Tfr（T follicular regulatory cells）细胞亚群,进而阻断NLRP3炎症小体通路,观察是否有助于缓解动物模型自身免疫性甲状腺炎症状,改善免疫微环境,以探究炎症小体在桥本甲状腺炎发病中的作用及其机制。研究方法:本研究收集3名未经治疗的桥本甲状腺炎患者和3名健康对照者新鲜甲状腺组织,剪碎经酶解后制备成符合要求的单细胞悬液,进行10X Genomics上机操作（步骤为单细胞进样、微磁珠附着、油滴隔离、涨破收集）,制备成油滴包裹物（GEM,Gel bead in emulsion）后立即进行反转录得到cDNA,构建文库,进行单细胞测序并采用Cell Ranger软件、Seurat软件分析炎症小体及其通路在各个细胞亚群中的表达。动物试验中,炎症小体多时点动态观察:将168只NOD.H-2h4小鼠（6周龄,约20g）随机分为2组（正常饮水组和高碘饮水组,各组雌雄各半）,正常饮水组给予无菌去离子水（ddH₂O）,高碘饮水组给予0.05%碘化钠饮用水（ddH₂O溶）,分别于喂碘0周、2周、4周、6周、8周、12周和16周处死小鼠留取甲状腺组织、脾脏和外周血。称量小鼠体重、甲状腺湿重,通过HE染色,观察甲状腺组织淋巴细胞浸润程度。通过RT-PCR检测各时点小鼠甲状腺炎症小体（NLRP3、AIM2、NLRP1、NLRC4）及其下游通路指标（IL-1β、IL-18、caspase-1）m RNA的表达。ELISA法检测小鼠血清中TgAb滴度。采用流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1、Th17、Tfh、Tfr细胞亚群所占比例。In vivo阻断NLRP3试验:1、抑制剂阻断:36只NOD.H-2^h4小鼠（6周龄,约20g）随机分为如下3组（各组雌雄各半）:正常饮水组:给予无菌去离子水（ddH₂O）;高碘饮水组:给予0.05%碘化钠饮用水（ddH₂O溶）,喂碘的同时按照20mg/Kg/d ddH₂O灌胃;高碘饮水+MCC950组（PRE组）:给予0.05%碘化钠饮用水（ddH₂O溶）,喂碘的同时按照20mg/Kg/d MCC950（ddH₂O溶）灌胃。8周后处死小鼠,留取标本。2、构建NLRP3基因敲除动物模型。利用NOD.H-2h4小鼠和NLRP3敲除（NLRP3-/-）的C57BL/6小鼠杂交建立了NOD.H-2^h4背景的NLRP3-/-小鼠、NLRP3+/-小鼠、NLRP3+/+小鼠。分组方法:根据基因型分为3组:NLRP3-/-组、NLRP3+/-组、NLRP3+/+组,取第六代出生6周后的小鼠（约20g）,每组分别分为高碘饮水组,给予NLRP3+/+组正常饮水作为对照。喂碘8周后处死小鼠,留取标本。结果:1、10X Genomics单细胞测序发现,与健康对照者相比,自身免疫性甲状腺炎患者甲状腺组织T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞亚群以及甲状腺细胞、上皮细胞等基质细胞亚群分群更为丰富。2、各亚群之间mRNA表达差异分析发现:炎症小体通路下游指标IL-1β在HT患者上皮细胞亚群中表达量显著高于健康对照者。3、HT患者甲状腺微环境中,免疫细胞以及甲状腺细胞等基质细胞存在复杂的信号交流。4、高碘喂养4周后,NOD.H-2h4小鼠甲状腺细胞炎症浸润程度、甲状腺相对重量、TgAb水平高于正常对照组（P<0.05）,并持续至16周。5、炎症小体及下游指标表达水平动态变化:高碘喂养2周后,NLRP3、NLRC4、IL-1β、IL-18、caspase-1mRNA表达水平开始升高（P<0.05）,并持续至16周;高碘喂养4周后,NLRP1A mRNA表达水平开始升高（P<0.05）;高碘喂养12周后,AIM2 mRNA表达水平开始升高（P<0.05）,并持续至16周。6、Th1/Th17/Tfh/Tfr细胞亚群比例多时点动态观察:流式细胞检测结果显示,CD4⁺IFNγ⁺Th1（Th1）淋巴细胞和CD4⁺IL17A⁺Th17（Th17）淋巴细胞亚群表达水平在实验8周开始出现差异（P<0.05）,并持续至16周;CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Foxp3^-Tfh淋巴细胞（ICOS⁺Tfh）、CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Foxp3⁺Tfr淋巴细胞（ICOS+Tfr）以及二者的比值（ICOS+Tfh/ICOS+Tfr）在实验第8周开始出现差异（P<0.05）,均持续至16周;CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Foxp3^-Tfh（PD-1⁺Tfh）淋巴细胞在实验12周、16周出现差异（P<0.05）,CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Foxp3⁺Tfr（PD-1⁺Tfr）淋巴细胞在各个实验时点均无差异（P>0.05）,二者的比值（PD-1+Tfh/PD-1+Tfr）在实验8周、12周、16周出现差异（P<0.05）。7、动物体内给予NLRP3特异性抑制剂MCC950:给予高碘饮水8周后,高碘组NOD.H-2h4小鼠甲状腺相对重量、血清TgAb水平、甲状腺淋巴细胞浸润程度均高于正常饮水组,且Th1、Th17、ICOS+Tfh/ICOS⁺Tfr、PD-1⁺Tfh/PD-1⁺Tfh细胞亚群出现稳态失衡,给予MCC950预防性阻断NLRP3后,小鼠血清TgAb水平下降,甲状腺组织淋巴细胞浸润程度减轻,炎性评分降低,各淋巴细胞亚群稳态失衡有所改善,但是甲状腺相对重量没有降低。8、NLRP3敲除动物模型:WT高碘组（H组）小鼠甲状腺相对重量、血清TgAb水平、甲状腺淋巴细胞浸润程度均高于WT对照组（N组）,敲除NLRP3后,NLRP3-/-高碘组、NLRP3+/-高碘组血清TgAb水平下降,甲状腺组织淋巴细胞浸润程度改善,炎性评分降低。然而甲状腺相对重量没有降低。结论:1、桥本甲状腺炎患者甲状腺微环境中存在多种免疫细胞,以T淋巴细胞为主,免疫细胞以及甲状腺细胞等基质细胞存在复杂的信号交流。2、HT患者上皮细胞亚群中IL-1β表达显著高于对照者。3、动物模型中,NLRP3、NLRC4炎症小体及其下游通路（IL-18、caspase-1、IL-1β）是自身免疫甲炎的早期改变之一,早于Th1、Th17、ICOS⁺Tfh/ICOS⁺Tfr、PD-1⁺Tfh/PD-1⁺Tfh细胞亚群出现稳态失衡时点。4、MCC950特异性阻断或者敲除NLRP3炎症小体,可以缓解NOD.H-2h4小鼠甲状腺炎发生的程度,但是甲状腺相对重量并不降低,提示阻断NLRP3炎症小体,并不能有效改善高碘引起的甲状腺滤泡细胞增大,但是可以改善各个淋巴细胞亚群稳态失衡。上述研究提示炎症小体及其信号通路参与自身免疫甲状腺炎的发生发展。