第一部分降钙素基因相关肽对表皮角质形成细胞增殖和表达血管内皮生长因子的影响背景银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其病因和发病机制至今未完全阐明。角质形成细胞（keratinocytes，KC）过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成是银屑病组织病理学最主要的特征。近来的研究发现血管生成的异常不但是银屑病特征性病理改变，而且可能是该病重要的启动因素。在银屑病的组织病理变化中真皮乳头血管的异常最先发生，而后出现炎症细胞的移行和表皮增生及分化异常，由此启动银屑病发生发展过程。同时，在血管的增生、迂曲以及渗透性增加的基础上，大量的免疫活性细胞如：T淋巴细胞、外周单核细胞、肥大细胞及其分泌的细胞因子渗出到血管外的组织中，诱导KC活化、增殖并分泌大量细胞因子，反过来促进血管异常的加重，由此形成细胞因子相互调控的恶性循环，促进疾病的进展。在银屑病的发生发展过程中，剧烈的精神刺激或应激反应被证实是银屑病发生和加重的重要诱因，但是这种临床现象的发生机制有待阐明。既往研究发现神经肽广泛存在于皮肤神经纤维和多种皮肤细胞，包括KC、朗格汉斯细胞、黑素细胞和淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞，同时上述细胞表面均分布有神经肽的受体。而神经肽是一类在脑组织和周围神经系统中广泛存在的微量肽类神经递质，介导神经与皮肤细胞之间的通讯联系，其重要的生物活性已经受到广泛关注。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是人和哺乳动物体内存在的一种新型的内源性生物活性神经多肽，是人皮肤组织中含量最丰富的一种多肽类神经递质。近来研究发现，银屑病病人皮损内CGRP的表达量显著增加，提示CGRP可能在银屑病的发病过程中扮演重要角色。并且发现CGRP不但是一种活性神经肽，还是一种内源性丝裂原，有促进多种细胞分裂、增殖的作用，CGRP在体外可促进体外原代培养的人成骨细胞增殖，并能剂量依赖刺激人齿龈成纤维细胞增殖活化，且这种作用可能与CGRP受体及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路的调控有关。MAPK是普遍存在于真核细胞中，是一类高度保守的丝氨酸（Ser）／苏氨酸（Thr）蛋白激酶，能将多种细胞外刺激产生的信号通过级联反应从细胞膜传递到细胞核内，在细胞增殖、分化、凋亡、应激、炎症以及免疫反应等多种生理和病理过程发挥着极其重要的作用。MAPK包括3个经典的亚家族途径，即细胞外调节激酶1／2（extracellular signal-regulated kinase 1／2，ERK1／2），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinases，JNK）和p38 MAPK。银屑病皮损区高表达的CGRP是否作为丝裂原刺激KC的增殖，并影响血管异常变化，目前未见报道，CGRP在银屑病病理生理改变中的作用及其机制有待阐明。因此本研究拟在体外培养的HaCaT细胞中，以主要由KC细胞分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）为主要指标，观察CGRP对KC增殖和表达VEGF的影响及其可能的细胞内信号转导机制，以阐明CGRP在银屑病发病、发展中作用机制具有重要意义。目的1．观察CGRP对人角质形成细胞株——HaCaT细胞增殖效应的影响；2．观察CGRP对HaCaT细胞表达VEGF的影响；3．探讨CGRP受体、MAPK信号途径在CGRP诱导的HaCaT细胞增殖以及表达VEGF中的作用。方法1．HaCaT细胞的培养用含10％FBS的DMEM置37℃CO₂培养箱中进行培养。2．实验设计1) HaCaT细胞给予不同浓度CGRP（0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM）孵育，测定HaCaT细胞增殖及VEGFmRNA和蛋白表达；2) HaCaT细胞给予CGRP孵育5～60min，部分给予CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、MEK（ERK1／2上游分子）阻断剂PD98059、p38 MAPK阻断剂SB203580或JNK阻断剂SP6001259预处理，测定ERK1／2、p38、JNK磷酸化改变；3) HaCaT细胞给予CGRP孵育，部分给予CGRP8-37、PD98059、SB203580或SP6001259预处理，测定HaCaT细胞增殖和VEGFmRNA及蛋白表达。3．甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定HaCaT细胞增殖将HaCaT细胞分组给予不同干预，加入MTT继续培养4h，再加入二甲基亚砜，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔吸光值。4．实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）检测VEGFmRNA表达将所收集的细胞提取总RNA，经逆转录反应得到cDNA，以管家基因β-actin作为参照，通过real-time RT-PCR技术检测VEGF mRNA的表达。5．双抗体夹心ELISA法检测VEGF蛋白表达将所收集的细胞培养上清进行孵育、酶反应、显色等步骤，酶联免疫检测仪450nm处测量各孔吸光值，根据标准曲线计算出相应浓度。6．Western blot检测ERK1／2、p38、JNK蛋白表达将所收集的细胞提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印迹、DAB显色、凝胶成像系统成像、Totallab成像分析软件进行半定量分析，检测ERK1／2、p38、JNK蛋白的表达。结果1．CGRP对HaCaT细胞增殖的影响在0.1 nM、1 nM、10 nM范围内CGRP呈浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖，与正常对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01），其中以CGRP浓度为10 nM时HaCaT细胞增殖作用最强，而100 nM CGRP组与对照组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。2．CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK1／2阻断剂PD98059、p38MAPK阻断剂SB203580及JNK阻断剂SP600125对CGRP诱导的HaCaT细胞增殖的影响CGRP8-37预处理后，CGRP诱导的HaCaT细胞的增殖明显降低（p＜0.01）；与正常对照组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。PD98059或SB203580预处理后，CGRP诱导的HaCaT细胞的增殖均明显被抑制（p＜0.01），但仍高于正常对照组（p＜0.01）；SP600125预处理后CGRP诱导的HaCaT细胞的增殖虽低于单纯CGRP孵育组，但差异无统计学意义（p＞0.05）。3．不同浓度的CGRP对HaCaT细胞VEGF mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响CGRP（0.1 nM、1 nM、10 nM）呈浓度依赖性促进VEGF mRNA和蛋白表达，与正常对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01），其中CGRP浓度为10 nM时VEGF mRNA和蛋白表达最高。4．CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK1／2阻断剂PD98059、p38MAPK阻断剂SB203580及JNK阻断剂SP600125对CGRP诱导的HaCaT细胞VEGF mRNA表达和VEGF蛋白的分泌影响CGRP8-37预处理后，CGRP诱导的HaCaT细胞VEGF mRNA及蛋白表达均明显降低（p＜0.01）；但仍高于正常对照组（p＜0.01）。PD98059预处理后CGRP诱导的HaCaT细胞VEGF mRNA及蛋白的表达均明显降低（p＜0.01），但仍高于正常对照组（p＜0.01）；SB203580预处理后或SP600125预处理后VEGF mRNA及蛋白表达虽低于单纯CGRP孵育组，但差异无统计学意义（p＞0.05），均高于正常对照组（p＜0.01）。5．MAPK信号转导途径在CGRP促HaCaT细胞增殖和表达VEGF表达中的作用10 nM CGRP在一定范围内时间依赖性促进ERK1／2、p38和JNK磷酸化。p-ERK1／2蛋白5min开始逐渐增强，10min达高峰，60 min后逐渐减弱；p-p38和p-JNK蛋白表达于5min达到高峰，30min后逐渐减弱；T-ERK1／2、T-p38、T-JNK蛋白表达各组之间差异无统计学意义（p＞0.05）。CGRP受体拮抗剂CGRPS-37预处理组p-ERK1／2、p-p38和p-JNK表达均明显降低；ERK1／2阻断剂PD98059预处理组p-ERK1／2表达明显降低；p38MAPK阻断剂SB203580预处理组p-p38明显降低；JNK阻断剂SP600125预处理组p-JNK表达也明显降低。结论1．CGRP在一定范围内（0.1 nM、1 nM、10 nM）浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖；2．CGRP可以上调HaCaT细胞VEGF mRNA和蛋白表达；3．CGRP可以时间依赖性活化HaCaT细胞ERK1／2、p38和JNK，CGRP受体可能参与了CGRP对ERK1／2、p38和JNK活化；4．CGRP受体、ERK1／2和p38 MAPK信号途径的活化可能在CGRP诱导的HaCaT细胞的增殖中发挥重要作用；CGRP受体、ERK1／2信号途径可能参与了CGRP上调HaCaT细胞VEGF表达的调控机制。机制最终都要归结到引起银屑病特征性病理改变：表皮角质形成细胞（keratinocytes，KC）增生过度和异常分化，炎症细胞（大多数为T细胞）浸润，真皮血管改变，如血管新生、扩张、迂曲。近年来研究的重要进展之一就是发现了一些起重要调控作用的信号转导通路在KC增殖与表达炎症因子中起重要作用。越来越多的证据显示，KC内信号转导途径的异常表达和（或）激活可能是导致银屑病特征性病理变化的分子基础。丝裂原活化蛋白激酶（mtiogen-activated protein kinase，MAPK）是90年代以来发现的最重要的生长信号调节蛋白，最先由Ray和Sturgill于1988年从3T3-L1脂肪母细胞中纯化出来，是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。MAPK超家族至少可分为三个亚家族：细胞外调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinases，JNK）和p38-MAPK。MAPK普遍存在于真核细胞中，能将多种细胞外刺激产生的信号通过级联反应从细胞膜传递到细胞核内，在细胞增殖、分化、凋亡、应激、炎症以及免疫反应等多种生理和病理过程发挥着极其重要的作用。在哺乳动物细胞MAPK信号转导通路与其他的许多通路之间存在广泛的交互作用，许多的信号途径最终都要和MAPK途径发生“交谈”（cross-talk）。MAPK被激活后可停留在胞质中，激活一系列其它蛋白激酶，亦可经核转位进入细胞核激活各自的核内转录因子完成对细胞刺激的反应。近年来对MAPK信号通路的研究已经取得很大进展，该信号通路在肿瘤中的作用已经取得了许多重要成果，然而在银屑病等KC增殖分化异常性皮肤病中的作用尚不清楚。因此，本研究拟通过观察寻常型银屑病病人皮损部位、非皮损部位和正常人皮肤组织中ERK1／2、p38、JNK的表达情况，以期探讨MAPK信号分子在银屑病发病中的病理生理学意义，研究的结果也可为寻找抗银屑病的靶位提供一些线索。目的检测寻常型银屑病病人皮损部位、非皮损部位和正常人皮肤组织中ERK1／2、p38、JNK的表达情况，初步探讨MAPK信号分子与银屑病的关系。方法1．标本来源银屑病病人12例均来自山东大学齐鲁医院皮肤科就诊患者，所有病例均经临床确诊为寻常型银屑病稳定期。所有患者近2周未外用糖皮质激素，近1个月未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂系统治疗。取材部位：躯干部或四肢部位局麻下切取1.0×0.5cm大皮损组织块，距皮损大于2cm的未受累的部位切取1.0×0.5cm大非皮损组织块。正常对照皮肤10例，来自本院美容整形手术病例。2．免疫印迹检测分别取银屑病病人皮损区、非皮损区以及正常人皮肤组织，提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印迹、DAB及ECL显色等步骤，检测ERK1／2、p38、TNK和p-ERK1／2、p-p38、p-JNK的表达的表达，并经凝胶成像分析系统半定量分析。3．免疫组织化学检测取银屑病病人皮损区、非皮损区以及正常人皮肤组织进行p-ERK1／2、p-p38、p-JNK免疫组织化学检测，所用一抗包括抗p-ERK1／2单克隆抗体（1∶100），抗p-p38单克隆抗体（1∶100），抗p-JNK1／2多克隆抗体（1∶100）。结果1．银屑病病人皮损处、非皮损处及正常人皮肤ERK1／2和p-ERK1／2表达的检测结果Western blot的结果表明银屑病病人皮损部位p-ERK1／2水平较非皮损部位显著增高（p＜0.05），ERK1／2蛋白的水平差异无统计学意义。p-ERK1／2免疫组织化学染色分析：染色阳性信号为棕色颗粒，银屑病病人皮损部位p-ERK1／2主要表达于表皮各层细胞的胞浆及胞核中，以胞核阳性表达为主，胞核内可见浓密的棕褐色颗粒；成纤维细胞和血管内皮细胞胞核均有阳性表达；p-ERK1／2在银屑病病人非皮损部位和正常人皮肤中主要表达于表皮各层细胞的胞浆中，少数基底层、棘层细胞胞核中可见浅棕色颗粒。2．银屑病病人皮损处、非皮损处及正常人皮肤p38和p-p38表达的检测结果Western blot的结果表明银屑病病人皮损部位p-p38水平较非皮损部位显著增高（p＜0.05），p38蛋白的水平差异无统计学意义。p-p38免疫组织化学染色分析：染色阳性信号为棕色颗粒，银屑病病人皮损部位p-p38主要表达于表皮各层细胞的胞浆及胞核中，胞浆、胞核内可见浓密的深棕色颗粒；成纤维细胞和血管内皮细胞胞核均可见深棕色颗粒；p-p38在银屑病病人非皮损部位和正常人皮肤中主要表达于表皮各层细胞的胞浆中，少数基底层、棘层细胞胞核中可见浅棕色颗粒。3．银屑病病人皮损处、非皮损处及正常人皮肤JNK和p-JNK表达的检测结果Western blot的结果表明银屑病病人皮损部位和非皮损部位皮肤p-JNK和JNK水平两者之间差异无统计学意义。p-JNK免疫组织化学染色分析：染色阳性信号为棕色颗粒，银屑病病人皮损部位、非皮损部位和正常人皮肤中主要表达于表皮各层细胞的胞浆中，胞浆内可见浅棕色颗粒，少数基底层、棘层细胞胞核中也有浅棕色颗粒。结论1．银屑病皮损中p-ERK1／2和p-p38的表达明显增高，提示ERK1／2及p38通路可能在银屑病发生、发展中起到重要作用。2．银屑病皮损中p-ERK1／2和p-p38主要表达于KC的胞核中，而在非皮损区及正常人表皮中则主要表达于KC胞浆，表明p-ERK1／2和p-p38在银屑病皮损区可能存在着向细胞核内的移位，通过磷酸化核转录因子或其他的激酶在银屑病的病理生理过程中发挥重要作用。