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目的:阐明胆红素对新生SD大鼠前庭内侧核(medial vestibular nucleus,MVN)神经元的兴奋毒性作用机制及拮抗措施。方法:切取含有前庭内侧核的P4-P6 SD大鼠幼崽脑片,使用重力加药系统给予胆红素,于给药前后采用细胞贴附式膜片钳技术记录前庭内侧核神经元自发放电(spontaneous spikes)频率与幅值;使用全细胞膜片钳技术记录胆红素引起的单个前庭内侧核神经元钠电流的变化。使用免疫荧光染色技术对胆红素作用前后细胞膜表面Nav1.1离子通道进行半定量检测。记录不同预处理条件(钙离子螯合剂BAPTA-AM等)对胆红素所致细胞自发放电频率及幅值改变的影响,并检测各条件下神经元凋亡比例。实验数据采用SPSS 22.0软件进行配对t检验、独立样本t检验。结果:首先我们使用膜片钳电生理技术记录了胆红素对于大鼠前庭内侧核自发性放电的影响,并得到如下结果:1、胆红素明显提高P4-6 SD大鼠前庭内侧核神经元自发放电的频率(control:214.80±4.09 spikes/min,BIL:249.20±5.62 spikes/min,p=0.002)与内外相幅值比值(control:Iinward/Ioutward=3.46±0.03,BIL:Iinward/Ioutward=4.30±0.03,P<0.001),导致细胞超兴奋,且该作用经3分钟灌流冲洗后依然存在(241.60±4.79spikes/min,P=0.008,Iinward/Ioutward=4.27±0.04,P<0.001),证明胆红素对前庭内侧核的作用是持续而不可逆转的。2、该现象由电压依赖性钠离子通道主导,且胆红素可以直接增加钠离子通道的电流密度(control:-199.41±16.04 p A/p F,n=12 neurons;BIL:-315.47±18.64p A/p F,P=0.004),并加快通道激活过程(Dx:control:5.69±0.19,BIL:4.61±0.32,P=0.009)、使通道半激活电压发生超极化(control:-23.99±0.86 m V,BIL:-30.14±0.73 m V,P<0.001);胆红素对钠离子通道失活没有明显影响(V0.5:control:-57.68±1.756 m V;BIL:-55.00±0.89 m V,P=0.216;Dx:control:6.12±0.17,BIL:5.94±0.12,P=0.433)。3、钙离子螯合剂BAPTA-AM可以阻断胆红素引起的自发放电频率(BAPTA-AM:123.00±5.12 spikes/min,BAPTA-AM+BIL:123.80±5.99 spikes/min,P=0.757)及幅值比值(BAPTA-AM:2.69±0.03,BAPTA-AM+BIL:2.69±0.02,P=0.846)的增加,证明胆红素对前庭内侧核的作用是一个胞内钙离子依赖的过程。4、蛋白质合成抑制剂cycloheximide可以部分阻断胆红素引起的自发放电频率(cycloheximide:180.80±7.07 spikes/min,cycloheximide+BIL:195.40±7.70spikes/min,P=0.023)及幅值比值(cycloheximide:2.79±0.02,cycloheximide+BIL:2.90±0.02,P<0.001,)增加,相对于单纯灌流胆红素,cycloheximide依旧发挥了部分拮抗作用(频率增幅:8.08%vs 16.02%,幅值比值增幅:3.85%vs.24.42%)。5、胞吐抑制剂TAT-NSF700可以阻断胆红素引起的自发放电频率(TATNSF700:194.00±1.97 spikes/min,TAT-NSF700+BIL:194.80±2.91 spikes/min,P=0.723)及幅值(TAT-NSF700:2.83±0.02 p A,TAT-NSF700+BIL:2.84±0.02 p A,P=0.633)增加,说明胆红素促进钠电流是一个胞内囊泡循环加速的过程。6、胞吞抑制剂Dynasore无法阻断胆红素引起的自发放电频率(Dynasore:234.40±4.20 spikes/min,Dynasore+BIL:264.60±7.39 spikes/min,P=0.011)及幅值(Dynasore:3.73±0.04,Dynasore+BIL:4.41±0.05,P<0.001)的增加,这证明胆红素促进钠电流不是通过减弱胞吞实现的。在明确了胆红素可以促进钠离子通道向胞膜转运从而提高神经元兴奋性后,我们使用免疫荧光成像技术对胞膜表面的钠离子通道Nav1.1进行了荧光半定量统计,并使用Calcein-AM/PI双染技术探索了细胞超兴奋与细胞凋亡之间的联系,得到如下结果:1、胆红素可以促进Nav1.1通道在细胞膜上的表达(control:39.46±1.61 AU,BIL:53.75±2.75 AU,P<0.001),同时可以导致前庭内侧核神经元的大量死亡(Death ratio:control:30.87±1.51%,BIL:69.13±1.51%,P<0.001)。2、BAPTA-AM可以阻断胆红素所致的Nav1.1通道表达增多(BAPTA-AM:50.66±4.63 AU,BAPTA-AM+BIL:50.79±3.35 AU,P=0.987),并且有效减少胆红素引起的细胞凋亡(BAPTA-AM+BIL:32.50±1.49%,P<0.001)。3、TAT-NSF700可以阻断胆红素所致的Nav1.1通道表达增多(TAT-NSF700:79.21±6.53 AU,TAT-NSF700+BIL:75.16±3.04 AU,P=0.570)并有效降低胆红素引起的细胞凋亡(TAT-NSF700+BIL:42.51±1.20%,P<0.001)。4、使用适宜浓度(25微摩尔)的利多卡因可以有效拮抗胆红素引起的前庭内侧核神经元超兴奋(control:188.80±9.30 spikes/min,Lidocaine+BIL:201.00±8.79 spikes/min,P=0.226)而不过分抑制钠通道活性,并有效的降低胆红素所致的细胞凋亡(BIL:69.13±1.51%,Lidocaine+BIL:37.60±1.32%,P<0.001)。5、BAPTA-AM和利多卡因都可以有效的降低脑片制备所致的基础凋亡率(Death ratio:Ctl:30.87±1.51%,Lidocaine:22.57±1.25%,P=0.012,BAPTA-AM:22.59±1.40%,P=0.018)。结论:胆红素可通过增加胞内钙水平,激活钙离子相关的蛋白质合成及胞内转运过程,促进电压依赖性钠离子通道Nav1.1在胞膜表达,继而引起神经元超兴奋及凋亡。Nav1.1或可成为早期预防新生儿胆红素脑病的潜在干预靶点。