菊粉酶产生菌的选育及其酶学性质的初步研究

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本文以实验室保藏的黑曲霉为出发菌株,对其进行了诱变,对突变株的发酵条件进行了优化,并对菊粉酶进行了分离纯化及酶学性质的研究,最后对菊芋粉的水解进行了初步研究,主要结论如下:(1)出发菌株黑曲霉YH-1的菊粉酶活力Ⅰ为60.9U/mL,I/S=0.38。对其进行了亚硝基胍诱变、高温和高菊芋粉相结合的梯度驯化后,最终选育出一株产酶较高的菌株YH-3,菊粉酶活力Ⅰ为85.2U/mL,I/S=0.38保持不变。(2)对菌株YH-3进行产酶培养基及发酵条件优化,确定最佳产酶培养基:菊芋粉25.2g/L、豆饼粉40g/L、蔗糖酯4.9g/L和氯化钠5.5g/L;最佳发酵条件:接种量0.8mL孢子液/瓶,发酵温度37℃,装液量80mL/500mL,发酵周期96h,在最佳的发酵条件下菊粉酶活力Ⅰ为196.0U/mL,比出发菌株提高了2.2倍。(3)发酵液经过硫酸铵分级沉淀、MonoQ5/50GL强阴离子柱、Superdex20010/300GL凝胶柱分离纯化,得到的两个外切型酶菊粉酶Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ。经过SDS-PAGE电泳验证,分子量分别为76kDa和65kDa。(4)对分离得到的菊粉酶组分进行酶学性质研究,发现Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ在pH2.6-5.0范围内比较稳定,最适pH均为3.6。两者最适温度均为68℃,50℃以下酶活较稳定,Exo-Ⅱ强于Exo-Ⅰ耐热性能。金属离子中Mn2+和Cu2+对Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ具有明显的激活作用,其次是Fe2+和Zn2+。K+对Exo-Ⅰ具有很强的抑制作用,对Exo-Ⅱ几乎没有影响。Ca2+对Exo-Ⅰ具有一定的促进作用,但对Exo-Ⅱ几乎没有影响。以菊糖为底物,测定菊粉酶的动力学参数,Exo-Ⅰ、Exo-Ⅱ的Vmax分别为23.6mmol/(mL·min)和5.3mmol/(mL·min),Km分别为1.89mmol/L和2.01mmol/L。(5)初步研究了粗酶液与分离得到的两个菊粉酶水解菊芋粉的条件及水解产物的分析,发现加酶量50u/g菊粉,水解10h,降解率达到88%以上。Exo-Ⅰ比Exo-Ⅱ降解菊芋粉的能力强。得到的水解液都以果糖为主,表明都是外切型菊粉酶。
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