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背景和目的发展抗肿瘤免疫治疗是一项具有高挑战性的工作,许多肿瘤表面的特异性抗原免疫原性很低。再加上肿瘤形成的免疫逃逸机制,使得它可以免受免疫系统的攻击,主要包括：处理加工抗原的能力下降、主要组织相容性复合体、免疫抑制性分子及细胞因子的表达下降。为了克服这一困难,科研人员不断尝试各种方法激活抗肿瘤免疫系统。其中包括：使用癌症疫苗、多克隆抗体的融合和免疫调节因子等。最具前景的就是自体肿瘤激活的T淋巴细胞,体外扩增到一定数目后进行过继性免疫治疗。目前应用这项技术已经取得了不错成果。但是,因为这种治疗需要一定数目的肿瘤特异性T细胞,使得这项技术现在仅应用于黑色素瘤。一些肿瘤内T细胞的数量很少,只有通过遗传修饰手段可以使其达到期望的数量。现已经报道的有两种方法,其一是多克隆T细胞可以靶向肿瘤抗原,此抗原经遗传修饰后具有T细胞受体特异性和亲和性。另外一种是通过修饰T细胞,使其表达嵌合性抗原受体来识别原始抗原。本课题在前人研究的基础上,利用分子克隆技术,构建EGFRvⅢ scFV-ICOS-CD3ζ,三质粒共转染293T细胞制备慢病毒(LV-EGFRvⅢ-ICOS/CAR),转染人外周血T淋巴细胞,探讨嵌合抗原受体EGFRvⅢ scFv-ICOS-CD3ζ修饰T细胞对表皮生长因子Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)阳性胶质瘤细胞的靶向杀伤作用,为肿瘤的靶向免疫治疗做出进一步的探索。方法1.利用分子克隆技术构建载体EGFRvⅢ scFv-ICOS-CD3ζ2.三质粒共转染293T细胞制备慢病毒(LV-EGFRvⅢ-ICOS/CAR),转染人外周血T淋巴细胞3.利用流式细胞仪和Western blot检测T细胞结合CAR的能力4.运用51Cr释放法检测ICOS/CAR+T淋巴细胞的特异性抗肿瘤效应5.采用ELISA法检测其细胞因子IFN-y的释放结果1.经PCR扩增、限制性内切酶酶切及核苷酸序列测定,证实获得pCDH-ICOS/CAR2.三质粒共转染293T细胞制备慢病毒,用p24ELISA法测定LV-ICOS-CAR的感染滴度约为1.8x106TU/ml3.慢病毒转染人外周血T淋巴细胞后,流式细胞仪检测CAR在T细胞表面的表达率为ICOS/CAR73.65%,该转染效率能够满足进一步的试验要求4. Western-Blot鉴定内源性CD3ζ表达,在57kD处有特异性的蛋白条带5.51Cr释放法证实ICOS/CAR+T淋巴细胞对EGFRvIII阳性的U87细胞有特异性杀伤作用6. ELISA法检测ICOS/CAR+T淋巴细胞细胞因子IFN-γ的释放,可高达(2103.6±97.58)pg/ml,证实了转染后淋巴细胞IFN-γ释放是EGFRvⅢ肿瘤抗原特异性的。结论EGFRvⅢ/CAR+T细胞在体外显示出肿瘤抗原特异性杀伤作用。本研究为脑胶质瘤细胞的靶向治疗提供了较为可靠的实验依据,为肿瘤免疫治疗早日应用于临床奠定了一定的基础。