论文部分内容阅读
胚胎发生是植物个体发育的起始,在这个过程中的细胞分化以及模式建成奠定了成熟种子发育和完整植株形成的基础。拟南芥是进行遗传研究的主要模式植物,虽然近年来已经有大量研究报道了拟南芥胚胎发育过程中的遗传途径和分子机制,但是对胚胎发育中不同组织、细胞间的交流以及复杂的调控网络仍知之甚少。叶绿体是植物不可或缺的一种半自主细胞器。叶绿体不仅是植物光合作用的关键场所,也负责一些重要化合物的合成和储存。叶绿体的正常发育与植物胚胎的形态发生密切相关,但是目前对叶绿体基因和蛋白影响胚胎发育的具体机制仍不清楚。在真核生物中,蛋白质的N端乙酰化修饰是最广泛的修饰过程之一,由N端乙酰转移酶催化完成。N端乙酰化修饰在蛋白质降解、蛋白质定位、蛋白质与细胞膜系统、以及蛋白质间的相互作用等方面均发挥举足轻重的功能。目前对N端乙酰化的研究主要聚集在人类和酵母中,对其在植物生长发育中的功能研究则相对较少。本研究通过分子生物学、遗传学、细胞生物学以及生物信息学等多种技术方法,以突变体为材料,初步研究了 3个编码叶绿体蛋白的基因在拟南芥胚胎发育中的作用。另外,对拟南芥中8个编码N端乙酰转移酶的基因进行表达和进化树分析,并鉴定了对应突变体。研究获得的主要结果如下:1、对拟南芥3个EM(EMBYRO-DEFECTIVCE)基因的5个T-DNA插入突变体进行纯杂合鉴定,结果显示em30,em33-1,em33-2,em54-1和em54-2均无法获得纯合植株,且杂合植株角果中均出现约25%的白化胚珠,并且最终褐化皱缩。遗传分析结果显示,5个突变体自交后代幼苗中有T-DNA插入与无插入的比例接近2:1,但是它们的雌、雄配子体传递率与野生型无明显差别,暗示这5个突变体的T-DNA插入并不影响配子体的发育,但是引起纯合胚胎致死。对野生型和同时期em突变体的白化胚珠进行透明观察,发现当野生型胚胎发育至心形期时,突变体em30,em33-1和em33-2的胚胎均出现两种表型特征:一种是胚胎发育停滞在球形期,胚体形态不规则且分裂面异常;另一种是胚胎能够分化出子叶原基,但是子叶之间的夹角与野生型相比明显增大,胚胎最终停滞在心形期。突变体em54-1和em54-2的胚胎发育均停滞在球形,且胚体表面分裂异常。利用转基因技术的回复实验证明,这5个突变体的胚胎败育表型可以回复,表明其表型是由对应基因的突变引起的。通过定量PCR以及启动子融合GUS表达分析,发现EM基因在各组织和器官中均有不同程度的广泛表达。为确定EM30,EM33和EM54是否为叶绿体蛋白,采用原生质体系统进行亚细胞定位实验,结果证明3个EM蛋白均定位于叶绿体。通过序列比对以及进化分析,发现EM30与DEA(D/H)-box RNA解旋酶家族的蛋白最同源,EM33和EM54分别属于PORR(Plant OrganelleRNARecognition)和YGGT蛋白家族,它们在系统进化过程中都高度保守。此外,通过定量PCR检测EM基因的表达是否受到光照影响,结果证明光信号是EM基因表达的重要调控因素。2、对拟南芥8个NAA(N-ALPHA ACETYLTRANSFERASE)基因的 12 个 T-DNA插入突变体进行纯杂合鉴定,结果显示除naa50-1/+和naa50-2/+外,其他突变体均能获得纯合植株。观察发现突变体naa30-1和naa30-2植株较野生型矮小,生长较缓慢,而其他突变体未发现营养生长缺陷的表型,此外12个突变体均无生殖发育的缺陷。通过RT-PCR技术检测纯合naa突变体中对应基因的表达水平,.结果表明突变体naa20,naa25-1,naa30-1和naa40-1中对应基因的表达水平与野生型相比无明显变化,突变体naa25-2,naa30-2,naa38,naa40-2,naa60-1和naa60-2中对应基因的表达水平与野生型相比有不同程度的下调,表明以上10个纯合突变体中的T-DNA均未导致对应基因的表达水平完全沉默。表达分析的结果显示,NAA基因在各组织和器官中以不同水平广泛表达,并且8个NAA基因在幼苗、花序和平展期的花中均有较高水平的表达。为了分析NAA蛋白在真核生物中的同源性,以不同物种中NAA同源蛋白的氨基酸序列构建系统进化树。进化分析结果表明,NAA蛋白在植物、动物以及酵母中均有很高的保守性;8个NAA蛋白的进化树也具有一定的相似性,表明在它们的进化过程也具有一定的保守性。