蛋白质酰胺侧链15N同位素标记技术的探究与应用

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近年来核磁技术已经发展成为一个遍及多门科学多个研究方向的重要分析手段,其在大分子蛋白质结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用、药物筛选、生物体新陈代谢体系研究等领域发挥着举足轻重的作用。为了更加充分的拓展核磁技术的应用和解决核磁技术的瓶颈问题,多种技术被开发出来。在蛋白质结构与功能研究领域,分子量增大引起的核磁谱峰重叠及线宽增加无疑是限制核磁技术在蛋白质研究中发展与应用的一大难题。为解决此问题,我们主要集中中于蛋白质选择性标记技术及顺磁核磁共振技术的开发与研究。蛋白质选择性标记技术可有效的解决谱峰重叠的问题,而顺磁核磁共振技术可以通过有限的数据提供长程距离信息。   本研究主要对蛋白质酰胺侧链进行15N选择性标记,简化核磁谱图,减少谱峰重叠。首先,我们在前人的基础上,以泛素蛋白-ubiquitin为模板蛋白,对蛋白质天门冬酰胺侧链进行单独15N标记,并对标记条件进行优化。通过对有可能影响天门冬酰胺生物合成途径的多个因素----如谷氨酰胺浓度、天门冬氨酸浓度、15NH4Cl浓度的筛选,我们完成了对将近98%的天门冬酰胺侧链进行15N标记。另外,我们对谷氨酰胺、天门冬酰胺侧链共同标记条件进行优化,提高其标记比例,最终完成对将近98%的谷氨酰胺与天门冬酰胺侧链进行15N标记。最后,我们将蛋白质酰胺侧链15N标记技术与顺磁核磁共振技术----PRE、PCS结合应用,我们发现通过蛋白质酰胺侧链的PCS可以准确拟合金属离子位置,且蛋白质酰胺侧链的PRE可与其同金属离子的距离高度一致,这充分证明了蛋白质酰胺侧链标记技术与顺磁核磁共振技术联合应用的可行性,同时也为酰胺侧链标记今后在药物筛选、蛋白相互作用、大分子量蛋白质结构与功能研究等领域的应用奠定了坚实的基础。
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