鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种急性、全身性传染病,是严重危害我国禽养殖业发展的常见性疫病。通常,鸡白痢沙门菌以侵害21日龄以内雏鸡为主,以白色下痢为致病特征,发病率和死亡率相对较高。成年种鸡多呈慢性或隐性感染,表现为无症状带菌,然而可以经过种蛋将病原垂直传播给子代导致孵化率和出雏率的降低。近年来,我国鸡白痢沙门菌的流行呈现新的特点,引起的感染表现出鸡群易感日龄增加以及临诊病型多样的趋势,其中以关节肿胀、跛行等为主要症状的关节炎致病型的疫情具有蔓延态势。鸡白痢既能水平传播又能垂直传播的流行特点,为其防控增添了难度。种群净化是控制鸡白痢的根本措施。然而,就目前我国养鸡业的现状而言,产业分散、饲养模式多样、管理水平参差不齐、鸡白痢疫情多发,检疫淘汰的策略实际操作起来成本过高,短期内尚无法广泛实施。在外界的关注和呼吁下,家禽养殖过程中抗生素的使用也正逐步减少。《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》提出,要结合实际情况制定实施种鸡场沙门菌病净化方案。根据我国养鸡业现状和长期以来对鸡白痢防控措施的探索,制定控制鸡白痢的方法应该取决于一个地区的感染水平。感染水平低或可实施检疫淘汰的地区可采取血清学检测和扑杀阳性鸡的手段进行净化,感染水平高或者无法进行淘汰扑杀的地区则考虑使用疫苗免疫和种群净化结合的综合防制措施。相较于灭活疫苗、菌影疫苗和亚单位疫苗等,减毒活疫苗免疫途径及诱导产生的免疫应答反应多样,能提供更有效的免疫保护。传统的疫苗免疫雏鸡后刺激产生的抗体与野生型细菌感染所产生的抗体无法区分,干扰沙门菌血清监测程序的正常实施。DIVA疫苗具有区分感染和免疫动物(Differentiationof Infected and Vaccinated Animals)的特征,应用于畜禽疫病的预防控制更显重要意义。沙门菌的血清监测主要依靠于检测动物针对细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)产生的抗体,玻板凝集试验是目前国内外广泛用于鸡白痢检疫诊断的方法。O-特异多糖(即O-抗原)由重复的寡糖单位呈链状结构排布于LPS最外层,是沙门菌的重要毒力因子,与致病性密切相关,参与维持细菌稳态、抵御环境压力、信号识别、黏附和定殖等。缺乏O-特异多糖链的LPS称为粗糙型LPS,含有一定数量或完整O-特异多糖结构的LPS称作光滑型LPS。沙门菌光滑型和粗糙型菌株之间无血清学交叉反应,因此,LPS是构建鸡白痢沙门菌DIVA疫苗合适的选择靶标。本文对致关节炎鸡白痢沙门菌的病原学及致病特征进行研究,以雏鸡感染模型成功复制出关节炎症状;证明了鸡白痢沙门菌O-特异多糖的致病作用;构建了 7个LPS合成相关基因突变株,从中筛选出具有理想的减毒效应、免疫保护力和DIVA特性的疫苗候选株S06004△spiC△rfaL,并对其进行了系统的疫苗评价。1.致关节炎鸡白痢沙门菌的分离鉴定与致病特征从表现有关节肿胀或破行等临床症状的病死鸡关节组织中分离鉴定鸡白痢沙门菌,对分离株进行抗生素耐药性、生物膜形成能力、CRISPR分子分型和毒力等分析,建立雏鸡感染模型复制关节炎症状,同时,利用全基因测序和比较基因组学的方法,分析致关节炎鸡白痢沙门菌的基因组特征。结果显示,关节组织中分离到的5株沙门菌经生化鉴定和血清型分析均为鸡白痢沙门菌。分离株对氨苄青霉素、链霉素和萘啶酮酸普遍耐药,对卡那霉素、氯霉素庆大霉素和呋喃妥因等抗生素较敏感。5株鸡白痢沙门菌的CRISPR间隔序列相同,CRISPR1 位点上依次为 Ent1、Ent2 和 Ent3,CRISPR2 依次为 EntBO、GallB1、GallB2、EntB8和EntB9var2,属于我国鸡白痢沙门菌CRISPR聚类分析中的最大分支。致关节炎鸡白痢沙门菌分离株具有较强的生物膜形成能力和鸡胚致死能力,对1日龄雏鸡的LD50在1.7×107CFU～7.2×107CFU之间。通过雏鸡致病模型,成功复制出关节炎症状,多数病例表现为一侧或两侧跗关节及周围组织肿大,逐渐发展为跛行、站立或行走困难。剖检病变可见跗关节明显肿胀,触之柔软有波动感,腱鞘略微肿大,关节腔内有淡黄色、清亮渗出液。组织病理切片主要表现为肝脏局部有坏死灶和炎性细胞浸润,脾脏淋巴细胞减少、坏死,有异嗜性粒细胞浸润等。致关节炎鸡白痢沙门菌在感染雏鸡的肝脏、脾脏、盲肠和跗关节腔等组织中均有分布。分离株的基因组长度为4855288 bp,核苷酸GC含量为52.1%,共注释到5006个基因。通过比对沙门菌MLST分型的管家基因序列,确定5株鸡白痢沙门菌的ST型均为ST92。鸡白痢沙门菌关节炎致病型菌株与白痢致病型菌株S06004基因组差异分析表明,两种致病型菌株同源性极高,存在46个非同义突变的ORF以及2213个单核苷酸多态性位点。以上结果为致关节炎鸡白痢沙门菌的病原学特征、分子致病机制和防控措施等方面的研究奠定了基础。2.鸡白痢沙门菌O-特异多糖的致病作用利用λ-Red同源重组技术敲除编码O-抗原连接酶的waa(同rfaL)基因,构建鸡白痢沙门菌S06004AwaaL::cat缺失株,对其生物学特性进行研究。缺失株与沙门菌09单因子诊断血清不发生凝集反应,而吖啶橙凝集为阳性,LPS结构不完整,O-特异多糖链缺失。鸡白痢沙门菌O-特异多糖的缺失,会影响细菌群体之间的凝集效应,缺失株表现出明显的自凝集现象。在酸性(pH 5.0)培养条件下,O-特异多糖的缺失影响鸡白痢沙门菌分泌蛋白的表达。LPS结构的完整性对于鸡白痢沙门菌抵抗蛋清和血清杀伤作用至关重要,O-特异多糖的缺失增强了细菌对蛋清和血清的敏感性。鸡白痢沙门菌waaL基因缺失后,细菌对DF-1细胞的黏附能力显著降低。通过鸡胚致死性试验,发现缺失株对12日龄鸡胚的致死性显著降低,在肝脏、脾脏、尿囊液和羊膜液中的定殖量明显低于野生株,表明O-特异多糖是鸡白痢沙门菌感染鸡胚和胚内定殖的关键毒力因子。与野生株相比,S06004△waaL::cat的LD50提高了近100倍,说明鸡白痢沙门菌O-特异多糖对于雏鸡是重要的致病因素。这些发现为进一步认识鸡白痢沙门菌的致病性和垂直传播的特征,制定合理的防控策略以及开发有效的疫苗提供了依据。3.鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因的缺失对毒力和免疫原性的影响为获得鸡白痢沙门菌粗糙型LPS突变株,研究不同结构的LPS对细菌生长、免疫原性、安全性和DIVA特性的影响,本部分利用λ-Red同源重组技术,缺失鸡白痢沙门菌rfaL、rfaJ、rfaI、rfaH、wzy、wzzB和fepE等基因,对其LPS结构进行定向改造,构建不同糖链结构或长度的突变株。其中,鸡白痢沙门菌S06004△spiC△rfaL::cat、S06004△spiC△rfaJ::cat、S06004△spiC△rfaH::cat、S06004△spiC△rfaI::cat和S06004△spiC△wzy::cat等缺失株的核心多糖或O-特异多糖的合成受阻,符合粗糙型LPS的特点。以上5个LPS合成相关基因的缺失均未引起鸡白痢沙门菌生化特性的改变,对生长速率也无显著影响。粗糙型鸡白痢沙门菌缺失株对鸡胚的毒力显著降低,对1日龄雏鸡的LD50与野生株相比均提高了 400倍以上。鸡白痢沙门菌粗糙型缺失株接种雏鸡后,在感染初期,S06004△spiC△rfaJ和S06004△spiC△rfaI在组织中的定殖量略低于其他3株。缺失株在肝脏中的定殖周期维持在21 d左右,在脾脏中维持约28d,随后即被机体清除。粗糙型突变株免疫组雏鸡经S06004攻毒后存活率均为 100%,S06004AspiC△rfaL、S06004△spiC△rfaH和 S06004△spiC△wzy 同时具有良好的对鸡伤寒沙门菌的交叉保护能力。LPS结构充分截短的缺失株(△rfaL、△rfaJ、△rfaI与△rfaH)接种雏鸡后,血清与检测抗原不发生凝集反应,S06004△spiC△wzy免疫组所制备的血清与检测抗原混合后有微弱的凝集颗粒。通过毒力、免疫保护效力和DIVA特征等方面综合评价,所构建的LPS合成相关基因缺失株中,S06004△spiC△rfaL::cat和S06004△spiC△rfaH::cat可作为疫苗候选株进一步评价。4.鸡白痢沙门菌DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用利用重叠延伸PCR(SOEing PCR)和自杀性质粒介导的同源重组技术,成功构建了无痕敲除rfaL基因的鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004△spiC△rfaL。疫苗株具有良好的遗传稳定性,传代后其生物学性状未发生改变,基因回复突变或毒力返祖的能力完全丧失。鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004AspiC△rfaL在干燥、缺乏营养的不利条件下持续生存能力显著降低,对紫外线暴露、氧应激、NaOH和消毒剂的敏感性增强,表明疫苗被接种动物排泄后更容易从环境中清除,具有良好的环境安全性。通过观察不同接种剂量的雏鸡反应,发现疫苗候选株以低于108CFU的免疫剂量接种雏鸡具有绝对的安全性。利用“seederchick”模型,对鸡白痢沙门菌疫苗株S06004△spiC△rfL的水平传播能力进行评估,结果表明,与野生株S06004相比,疫苗株在鸡群中的水平传播能力较低。疫苗接种不影响雏鸡生长,在免疫14 d以后,免疫组雏鸡的抗体水平持续增高,显著高于对照组(P<0.01),表明鸡白痢沙门菌疫苗株S06004AspiC△rfaL能诱导雏鸡产生良好的体液免疫应答。通过细胞增殖ELISA定量分析,疫苗株免疫后第21 d,鸡外周血淋巴细胞增殖的SI值(3.197±0.068)显著高于对照组(1.05±0.1)。而且疫苗接种组CD4+和CD8+T细胞的相对数量均显著增加,与对照组相比,分别提高约2倍和1.5倍。以上说明,疫苗株能够刺激机体产生显著的细胞免疫应答。雏鸡攻毒保护试验表明,疫苗不仅具有理想的针对不同致病型鸡白痢沙门菌感染的保护效力,还具有针对鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的交叉保护能力,同时免疫雏鸡后能有效地诱导机体清除强毒菌株的感染和定殖。疫苗株缺失的spiC基因和rfaL基因可作为分子鉴别标记,通过PCR与野生株菌株区分。鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004△spC△rfaL缺少O-抗原结构,雏鸡免疫后血清不与鸡白痢鸡伤寒多价染色抗原发生凝集反应,通过简单易行的血清玻板凝集试验,即可有效区分疫苗免疫雏鸡和野生菌感染雏鸡,表现出显著的DIVA特征。