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目的:1.模拟挤压综合征(crush syndrome,CS)中的肌红蛋白(myoglobin,Mb)释放对大鼠肾小管上皮细胞的胁迫作用,以得到Mb诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡的实验指向。2.确定大鼠肾小管上皮细胞凋亡是否由CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)促进的通路介导,是否与未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)途径吻合。3.寻找在该实验的细胞凋亡过程中相关的lnc RNAs/m RNAs的改变,利用生物信息学分析差异表达lnc RNAs/m RNAs的调控关系,共表达情况及信号通路情况,找到有意义的lnc RNAs。方法:1.Mb处理细胞模型的建立收集大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E并接种到细胞培养板中,将不同浓度的Mb添加至培养板中,未用Mb(0μM)处理的组定义为对照组,用Mb处理的组按照Mb浓度定义为100μM,150μM和200μM组。2.用乳酸脱氢酶(LDH)法测定NRK细胞活性3.利用TUNEL染色和流式细胞仪检测NRK细胞的凋亡4.蛋白质印迹法(western blot,WB)和荧光定量PCR检测内质网应激相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平5.Lnc RNAs/m RNAs芯片技术分析NRK细胞凋亡过程中的lnc RNAs/m RNAs改变6.通过q RT-PCR验证lnc RNAs/m RNAs芯片结果根据差异表达lnc RNAs的倍数变化值以及lnc RNAs在数据库中是否具有确定的序列,我们选择了6个差异表达的lnc RNAs(3个上调和3个下调),并通过q RT-PCR检测其表达。7.GO富集与KEGG通路分析差异表达lnc RNA s/m RNAs的调控关系,共表达情况及信号通路情况结果:1.Mb降低NRK细胞的活力通过显微镜观察到的细胞形态,我们发现随着Mb浓度的增加,细胞活力降低。当Mb浓度大于100μM时,细胞出现增殖停滞。当Mb浓度到达200μM时,几乎全部细胞均从培养皿基质上脱落,出现大量皱缩细胞和细胞碎片。LDH测定结果表明用Mb处理的NRK细胞受到更严重的损伤,并且损伤呈剂量依赖性。2.Mb促进NRK细胞发生凋亡TUNEL染色结果显示,对照组中没有明显的TUNEL阳性细胞,然而,经过Mb处理的NRK细胞中TUNEL阳性细胞的数量明显增加。经Annexin V/PI染色后通过流式细胞仪检测到的结果与TUNEL法的结果一致,也表明Mb促进NRK细胞发生凋亡。3.Mb通过内质网应激途径诱导NRK细胞发生凋亡蛋白质印迹法结果表明,Mb以浓度依赖的方式显著增加了NRK细胞中GRP78,IRE1,XBP1,CHOP和Caspase-12的表达,这些数据表明Mb通过内质网应激途径诱导NRK细胞凋亡。RT-PCR结果显示,在暴露于不同浓度的Mb24h后,NRK细胞的GRP78,XBP1和ATF6的表达显著增加。4.Mb组NRK细胞中差异表达的lnc RNAs/m RNAs结果分析Lnc RNAs/m RNAs芯片技术结果表明,与对照组相比,Mb处理组有310个lnc RNAs和525个m RNAs表达差异显著。在310个lnc RNAs中,有148个lnc RNAs被上调,而162个lnc RNAs被下调。在525个m RNAs中,有274个m RNAs被上调,而251个被下调。5.q RT-PCR验证lnc RNAs/m RNAs芯片结果q RT-PCR的结果跟lnc RNAs/m RNAs芯片的结果大体相同,说明了lnc RNAs/m RNAs芯片在挑选差异表达基因中的可靠性。6.差异表达的m RNAs的GO富集和KEGG通路分析进行GO富集和KEGG途径分析以确定差异表达的m RNAs的功能和途径,我们发现它们显著富集在某些功能和途径,例如细胞增殖,对雌二醇的反应,衰老,Fox O信号传导途径和物质代谢(包括谷胱甘肽,胆固醇,脂肪酸)。结论:1.Mb抑制大鼠肾小管上皮细胞的活力,促进细胞凋亡。2.内质网应激在Mb促细胞凋亡中发挥了作用。3.大鼠肾小管上皮细胞凋亡由CHOP促进的通路介导,与UPR途径吻合。4.差异表达的lnc RNAs调控的靶基因(m RNAs)可能参与例如细胞增殖,对雌二醇的反应,衰老,Fox O信号传导途径和物质代谢(包括谷胱甘肽,胆固醇,脂肪酸)这些功能与途径。我们发现这些病理过程与内质网维持的体内稳态及内质网应激有关。生物信息学分析的结果表明,差异表达的lnc RNAs的靶基因通过调节以上功能和途径,来调节内质网应激和细胞凋亡。