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研究目的本实验基于炎症消散的理论,以巨噬细胞脂质清除和泡沫细胞的凋亡为切入点,观察参莲（SL）提取物对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导的腹腔巨噬细胞泡沫化和凋亡的药效,探讨SL提取物调控内质网应激保护泡沫细胞凋亡的作用机制及不同提取部位的活性比较。一方面明确SL提取物全方对AS炎症消散进程的影响和对脂质过氧化炎症损伤平衡的重塑。另一方面通过评价和比较SL提取物不同提取组分药效的责献度和活性差异,为SL提取物组方科学性和优效性提供初步的研究提示和思路。同时为SL提取物治疗动脉粥样硬化提供新的理论基础和实验依据,揭示SL提取物在脂质摄取过程中内质网应激保护的药理机制。实验方法1.SL提取物对AS模型小鼠斑块脂质清除的作用机制研究采用右侧颈动脉套管法联合高脂喂养建立ApoE基因敲除C57BL/6J小鼠动脉粥样硬化模型,ApoE基因敲除小鼠按体重随机分为6组,分别为假手术组（Sham）,模型对照组（Model）,阳性药瑞舒伐他汀组（P,0.1 mL/10g/d）,SL提取物低剂量组（SL-L,95 mg/kg/d）、中剂量组（SL-M,190 mg/kg/d）、高剂量组（SL-H,380 mg/kg/d）。于9周末进行动物取材。通过免疫组化技术,检测AS模型小鼠主动脉弓内膜吞噬受体CD36表达情况;通过免疫荧光双染技术,检测AS模型小鼠主动脉弓内膜下巨噬细胞吞噬受体CD36表达情况;通过免疫组化技术,检测AS模型小鼠主动脉弓内质网应激促凋亡信号通路关键调控分子CHOP蛋白表达情况和促存活信号通路关键调控分子XBP-1蛋白表达情况;通过免疫组化技术,检测AS模型小鼠主动脉弓内质网应激标志物GRP-78蛋白表达情况。2.SL提取物及其部位对脂质过氧化物清除的药效活性研究采用ox-LDL诱导小鼠腹腔巨噬细胞建立炎症损伤模型。从C57BL/6J雌性小鼠腹腔中收集腹腔巨噬细胞,体外培养72 h后,分为7组,阴性对照组（NC）,模型组(Model,ox-LDL,20 mg·L-1),丹参水溶性提取物组(DS,4.32 mg·L-1+20 mg·L-11 ox-LDL),丹参脂溶性提取物组(DZ,2.5mg·L-1+20 mg·L-11 ox-LDL),穿心莲脂溶性提取物组(C,3.18mg·L-1+20 mg·L-11 ox-LDL),SL提取物组(10mg·L-1+20 mg·L-11 ox-LDL),内质网应激诱导剂衣霉素组(TM,1 mg·L-1),药物处理24 h。油红O染色观察脂质积累的情况;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞的凋亡情况。3.SL提取物及其部位对脂质过氧化物清除的作用机制研究采用ox-LDL诱导小鼠腹腔巨噬细胞建立炎症损伤模型。分组同上实验方法2,通过反转录PCR法（reverse transcription PCR,RT-PCR）检测吞噬相关受体:清道夫受体CD36、Annexin A1 mRNA的表达;通过间接免疫荧光技术检测腹腔巨噬细胞CD36的表达;通过钙离子荧光探针检测腹腔巨噬细胞内钙离子浓度的水平;通过Western blot法检测腹腔巨噬细胞C/EBP同源蛋白CHOP、Caspase-12、XBP-1蛋白的表达,比色法测定Caspase-3酶的比活力。实验结果1.SL提取物对AS模型小鼠斑块脂质清除的作用机制研究与假手术组相比,模型组小鼠主动脉弓内膜下吞噬受体CD36蛋白表达水平上调,内质网应激促凋亡信号通路关键调控分子CHOP蛋白表达水平上调,内质网应激促存活信号通路关键调控分子XBP-1蛋白表达水平下调,内质网应激标志物GRP-78表达上调。与模型组相比,阳性药瑞舒伐他汀组小鼠主动脉弓内膜下吞噬受体CD36蛋白表达水平上调,内质网应激促凋亡信号通路关键调控分子CHOP蛋白表达水平下调,内质网应激促存活信号通路关键调控分子XBP-1蛋白表达水平上调,内质网应激标志物GRP-78表达下调。与模型组相比,SL提取物各剂量组小鼠主动脉弓内膜下吞噬受体CD36蛋白表达水平上调,内质网应激促凋亡信号通路关键调控分子CHOP蛋白表达水平下调,内质网应激促存活信号通路关键调控分子XBP-1蛋白表达水平上调,内质网应激标志物GRP-78表达下调。2.SL提取物及其部位对脂质过氧化物清除的药效活性研究与阴性对照组相比,模型组脂质过氧化物ox-LDL能够导致腹腔巨噬细胞脂质沉积,增加吞噬了ox-LDL后巨噬细胞的凋亡率,降低了巨噬细胞对ox-LDL的清除有效性。与模型组相比,SL提取物作用于腹腔巨噬细胞24h后,能够显著降低吞噬ox-LDL后引起的巨噬细胞脂质沉积;同时SL提取物能够显著减少吞噬了ox-LDL后巨噬细胞的凋亡率。在与模型组相比药效有统计学差异并且整方有效的基础上,穿心莲脂溶性提取物减少巨噬细胞脂质沉积的药效优于丹参各提取部位（P<0.05）;丹参脂溶性提取部位和丹参水溶性提取部位减少巨噬细胞凋亡的药效优于穿心莲穿心莲脂溶性提取部位（P<0.05）。3.SL提取物及其部位对脂质过氧化物清除的作用机制研究与阴性对照组相比,模型组脂质过氧化物ox-LDL能够引起巨噬细胞吞噬受体CD36 mRNA和蛋白表达水平上调,增加内质网应激促凋亡信号通路关键分子CHOP mRNA和蛋白表达水平以及Caspase-12蛋白活化程度。而内质网应激诱导剂衣霉素组实验结果与模型组一致。与模型组相比,在模型组CD36表达上调的基础上,SL提取物能够进一步上调巨噬细胞吞噬受体CD36 mRNA和蛋白水平的表达;同时SL提取物能够有效降低吞噬了ox-LDL后的巨噬细胞内钙离子浓度,显著减少内质网应激促凋亡信号通路关键分子CHOP、Caspase-12蛋白表达水平。在与模型组相比药效有统计学差异并且整方有效的基础上,穿心莲脂溶性提取部位上调巨噬细胞CD36表达的药效优于丹参各提取部位（P<0.05）;丹参脂溶性提取部位和丹参水溶性提取部位减少内质网应激促凋亡信号通路关键分子CHOP、Caspase-12蛋白表达水平的药效优于穿心莲穿心莲脂溶性提取部位（P<0.05）。结论1.SL提取物能够通过提高AS模型小鼠主动脉弓内膜处吞噬受体CD36的表达,促进脂质过氧化物的吞噬,同时下调CHOP的表达,上调XBP-1的表达,减少内质网应激标记物GRP-78的表达,从而缓解内质网应激,提高AS斑块脂质清除的有效性,维持有效的胞葬作用,促进炎症消散。2.SL提取物可以显著上调腹腔巨噬细胞CD36的表达,促进ox-LDL的摄取,同时可有效降低腹腔巨噬细胞对ox-LDL摄取后脂质的蓄积和凋亡,提高巨噬细胞生存的状态,从而有效清除脂质过氧化物。3.SL提取物可能通过抑制内质网应激CHOP/Caspase-12/Caspase-3促凋亡信号通路抑制脂质过氧化物诱导的细胞凋亡。4.在整方活性可靠稳定的基础上,穿心莲脂溶性提取物上调CD36的表达,减少脂质沉积的药效优于丹参各提取物部位;而丹参提取部位能够减少巨噬细胞的凋亡药效优于穿心莲脂溶性提取物部位。