论文部分内容阅读
芽孢杆菌作为一类非常重要的生防微生物资源,已用其开发出了众多的微生物杀菌制剂。但是目前的制剂产品仅仅以芽孢的数量作为质量评价指标,在制剂的加工过程中,多数的厂家会将发酵液中的抑菌活性物质进行浓缩干燥,然后加入到制剂中,并没有对抑菌活性物质的种类进行定性定量分析。芽孢杆菌类生防菌通过多种抑菌机理达到抑菌作用,包括竞争作用、溶菌作用、拮抗作用、诱导植物抗性等,并且因菌株和发酵条件不同,抑菌活性物质的种类和含量也会有较大的差异,所以这类微生物农药的质量不能仅仅通过芽孢数量来进行准确评价,只有同时对制剂产品所含的芽孢数量和抑菌活性物质进行定性定量分析,才能对这类微生物农药的质量进行准确全面地评价。本论文选取植物内生菌解淀粉芽孢杆菌SWB16,对其进行发酵培养,根据实验室之前的研究成果,采用特定的针对脂肽抗生素的分离提取办法,对得到的解淀粉芽孢杆菌SWB16发酵液上清液进行处理,得到发酵产物的甲醇提取液。针对得到的发酵产物粗提物进行了以下实验研究：(一)利用本实验室分离得到的一株球孢白僵菌,对得到的发酵产物甲醇提取液进行活性检测,通过拮抗试验,研究了活性产物对球孢白僵菌孢子萌发以及菌丝生长的抑制作用,在其作用下可使球孢白僵菌孢子失去萌发能力或是使孢子直接破裂、使球孢白僵菌菌丝消融、变细,原生质体外漏,菌丝体扭曲变形,形成泡囊结构等；同时研究表明活性产物对温度、紫外线、蛋白酶K等都具有良好的耐受性且是菌株SWB16发酵液中抑制球孢白僵菌生长的主要成分。(二)通过利用HPLC、LC-MS技术对得到的活性粗提物进行定量定性分析,将得到的活性产物各组分分子质量与脂肽抗生素各种类理论相对分子质量相对比,同时结合之前实验中观察到的实验现象,发现,活性提取物中含有Iturins、 Fengycins和Surfactins三大类脂肽抗生素。其中,Iturins类含有C14-IturinA、 C15-IturinA、C16-IturinA、C17-IturinA四种; Fengycins类含有的种类仅通过LC-MS技术不能确定,很可能同时含有C15-FengycinA、C16-Fengycin、C17-FengycinA、 C18-FengycinA和C14-FengycinB、C15-FengycinB、C16-FengycinB、C17-FengycinB这两类同系物；而Surfactins可能含有的种类包括C13-SurfactinA、C14-SurfactinA、 C15-SurfactinA和C14-SurfactinB、C15-SurfactinB、C16-SurfactinB、以及C13-SurfactinC、C14-SurfactinC、C15-SurfactinC这三类同系物。总的这三大类脂肽抗生素占粗提物的相对质量达到了77.216%。(三)通过单因素实验方法对菌株SWB16的发酵条件进行初步优化,初步确定SWB16的最佳发酵条件是初始pH7.0、接种量5%、发酵培养温度30℃、发酵时间36h、装液量60ml(250ml三角瓶)、摇床转速为190rpm,脂肽抗生素从发酵上清液中绝大多数沉淀出来所需的pH值为3。利用以上实验得出的发酵条件以及沉淀条件对解淀粉芽孢杆菌SWB16进行发酵,最后得到的脂肽抗生素的产量达到了0.072g/100ml。