本文采用细胞学， 生物化学， 分子生物学和蛋白质组学等技术， 对对虾的抗菌能力和免疫防御机制进行研究， 筛选了灵敏稳定的抑菌和溶菌检测方法； 并对灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和海带多糖(laminarin， 一种B-1, 3 葡聚糖)免疫诱导后的中国明对虾( Fenneropenaeus chinensis )血细胞数目， 血淋巴的抑菌活力， 溶菌能力， 溶酶体膜的稳定性进行分析； 对两种重要免疫因子溶菌酶(LYZ)和精氨酸激酶(AK)进行克隆和表达分析。 得到以下结果： 中国明对虾受到免疫诱导后血细胞数量表现出明显变化。 1 10-7 灭活鳗弧菌攻毒后血细胞数量明显降低, 最低值出现在攻毒后45min 总血细胞数量(THC)下降了73%(p<0.05)， 随后逐渐回升， 至48h恢复注射前水平。 注射海带多糖试验组的对虾血细胞数量明显高于对照组， 最高值出现在注射后3h(p<0.05)， THC比对照组高出一倍， 注射后12h， 接近对照组水平。 注射生理盐水引起了THC的少量增加， 但很快恢复到注射前水平。 采用中性红保留时间分析体外不同剂量海带多糖对溶酶体膜稳定性的影响结果显示， 在海带多糖浓度为 1 10-5mg/ml 至 0.1mg/ml 之间时中性红保留时间均有所增加， 最长的中性红保留时间为 205min ，对应的海带多糖浓度为 1 10-3mg/ml， 但是当海带多糖浓度为 1mg/ml 时， 溶酶体膜中性红保留时间缩短。 体内注射海带多糖明显增加了溶酶体膜的稳定性， 中性红保留时间在每尾虾注射0.1mg 海带多糖后明显延长， 最长的保留时间出现在注射海带多糖后 3h， 保留时间为 180min(p<0.05) 然后逐渐下降， 48h 时恢复对照组水平。 对照组的中性红保留时间为 ８１ｍｉｎ， 与非注射组相比没有明显差别 。与鳗弧菌体外混合和体内注射均引起了血细胞溶酶体膜稳定性的显著降低。 通过对抑菌检测方法进行筛选， 结果表明液体培养基微量稀释评估法抑菌效果灵敏度最高， 抑菌圈法灵敏度最低， 但对于对虾的血浆， 辐射扩散法被证明在抑菌活性检测方面更为适用。 利用改进的辐射扩散法对灭活鳗弧菌攻毒前后的中国明对虾血细胞和血浆的抑菌活性进行了检测， 结果显示， 虽然攻毒后血细胞数目显著降低(p<0.05)，但其抑菌能力却明显增强(p<0.05)，相对而言，血浆抑菌活性变化不显著(p>0.05)，说明血细胞在受到免疫刺激后抗菌因子的表达进一步加强。 III<WP=5>姚翠鸾 免疫刺激后中国明对虾血液抗菌力变化及两种免疫相关因子 LYZ 和 AK 的研究 博士学位论文 在未经免疫诱导的中国明对虾的血浆中， 未检测到溶菌酶活性， 仅在血细胞中检测到溶菌酶活性。 血细胞溶菌酶活性在用灭活鳗弧菌和海带多糖进行免疫诱导后均表现出上升趋势。 灭活的鳗弧菌引起血浆溶菌酶活性增加， 但海带多糖诱导后没有检测到溶菌酶活性。 对虾生理盐水诱导引起血细胞溶菌酶活性的少量增加， 但未检测到血浆溶菌酶活性。 采用 Rotofor? cell 对溶菌酶活性较高的血淋巴样品进行分离， 发现它含有 pI9.2 和 pI10.0 的两种不同等电点的溶菌酶， 其中 pI为 10.0 的组分具有几丁酶活性。 实验采用同源克隆和 ＲＡＣＥ　ＰＣＲ 的方法， 在中国明对虾血液 ｃＤＮＡ 中获得了全长为 ８１７ｂｐ 中国明对虾 ｃ 型溶菌酶　ｃＤＮＡ 序列。 该序列包含中国明对虾 ｃ 型溶菌酶的成熟肽区域， １１７ｂｐ 的 ５ 端非翻译区， ４６８ｂｐ 的开放读码框和 ２２６ｂｐ的 ３ 端非翻译区。 ３ 端非常保守， 加尾信号（ＡＡＴＡＡＡ）位于终止密码子 ＴＡＧ 下游 １９４ｂｐ 处。 推测的溶菌酶成熟肽蛋白质序列由 １３８ 个氨基酸组成，理论分子量为 １５９９７．９５ 理论等电点为 ９．７９。 应用大肠杆菌对体外重组的溶菌酶基因成功地进行了表达。 溶菌酶重组蛋白在胞浆中形成了不溶的包涵体， 采用提取缓冲液变性后， 以 Ｃｏ－亲和层析柱对它进行纯化。 在变性条件下， 获得了纯度较高的中国明对虾 ｃ 型溶菌酶重组蛋白， 经复性后表现出溶菌酶活性 。　 本实验还首次利用蛋白质组学技术对2D凝胶上的精氨酸激酶成功进行了鉴定， 并发现在海带多糖注射后 45min的血浆中精氨酸激酶是变化最明显的蛋白之一。 克隆得到了１１８４ｂｐ编码中国明对虾精氨酸激酶的ｃＤＮＡ片段， 包含一个1068bp的开放阅读框， 根据其推断的蛋白质包含 356 个氨基酸残基， 理论分子量为40129.73Da， 等电点为 5.92， 进化十分保守。 海带多糖免疫刺激后 3h， 精氨酸激酶的表达量明显回升。