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[背景]帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病,其病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的死亡和路易体的积累,其典型的运动症状主要包括震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势异常。目前PD的治疗包括药物治疗和手术治疗,但所有治疗都无法避免神经元退行性变的发展。既往研究表明,丰富环境对亨廷顿病、阿尔茨海默病和PD等神经退行性疾病具有积极的影响,但丰富环境的作用机制一直没有明确。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一种神经营养因子,在维持神经细胞的结构和功能中起重要作用,广泛参与多种中枢神经系统疾病的病理过程。本实验通过构建6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)PD大鼠模型,检测丰富环境干预下大鼠中脑BDNF表达的变化,以探讨丰富环境作用的可能机制。第一部分:6-OHDA对大鼠行为学及中脑多巴胺能神经元的影响[目的]探讨6-OHDA对大鼠行为学及中脑多巴胺能神经元的影响,构建有效稳定的6-OHDAPD大鼠模型。[方法]45只wistar大鼠中随机选取36只采用6-羟基多巴胺单侧两点注射法损伤纹状体,在术后2周、3周、9周、12周行阿扑吗啡诱导旋转实验检测成功的PD模型,并以旷场实验评价大鼠行为学改变,以尼氏染色和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色观察大鼠中脑神经元的变化情况。另9只大鼠在相同部位注射等量的溶剂作为假手术组。[结果](1)阿扑吗啡诱导旋转实验:36只6-OHDA组大鼠死亡4只,存活的32只6-OHDA组大鼠中有24只大鼠30分钟内旋转圈数大于210圈,并且至少可维持12周。(2)旷场实验:与假手术组大鼠相比,6-OHDA组大鼠length、dist1、MF1、Vmean1较小,而RT1较大,差异有统计学意义(P<0.05)。各组间dist2、RT2、RT2%、Vmean2比较,差异无统计学意义(P>0.05)。注射6-OHDA后,第2周和第3周上述观察指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与第2周比较,第9周的length、MF1、Vmean1、dist2、MF2、Vmean2较小,差异有统计学意义(P<0.05);RT1、RT1%较大,差异有统计学意义(P<0.05);而dist1、RT2%、RT2差异无统计学意义(P>0.05)。与第2周比较,第12周的length、MF1、Vmean1、dist2、MF2、RT2%、RT2较小,差异有统计学意义(P<0.05);RT1%、RT1较大,差异有统计学意义(P<0.05);dist1、Vmean2差异无统计学意义(P>0.05)。注射6-OHDA后,与第3周比较,第9周的length、MF1较小,RT1、RT1%较大,差异有统计学意义(P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。与第3周比较,第 12 周的 length、dist1、MF1、Vmean1、RT2%、RT2、MF2 较小,RT1、RT1%较大,差异有统计学意义(P<0.05),而dist2、Vmean2差异无统计学意义(P>0.05)。注射6-OHDA后,与第9周比较,第12周各项观察指标差异无统计学意义(P>0.05)。(3)尼氏染色:假手术组大鼠纹状体及黑质神经细胞排列密集,胞浆尼氏体丰富,而6-OHDA组损伤侧纹状体及黑质神经细胞排列较稀疏,细胞间隙增大,胞浆内尼氏体减少。(4)TH免疫组化染色:各组间损伤侧纹状体TH阳性纤维光密度比较存在差异,差异具有统计学意义(F=225.450,P<0.05)。注射6-OHDA后第2周、第3周、第9周、第12周纹状体TH阳性纤维光密度小于假手术组,差异有统计学意义(P均小于0.05)。注射6-OHDA后不同时间两两比较,术后第3周、第9周、第12周纹状体TH阳性纤维光密度小于第2周,差异有统计学意义(P均小于0.05);但第3周、9周、12周之间比较,差异无统计学意义(P均大于0.05)。各组间损伤侧黑质TH阳性细胞数目比较,差异具有统计学意义(F=737.171,P<0.05)。注射6-OHDA后第2周、第3周、第9周、第12周损伤侧黑质TH阳性细胞数目小于假手术组,差异有统计学意义(P均小于0.05)。注射6-OHDA后不同时间两两比较,术后第3周、第9周、第12周黑质TH阳性细胞数目小于第2周,差异有统计学意义(P均小于0.05);但第3周、9周、12周之间比较,差异无统计学意义。[结论]6-OHDA毁损法可建立有效且稳定的PD大鼠模型。6-OHDA对大鼠中脑多巴胺能神经元的损伤在术后3周后逐渐达到稳定,对大鼠运动功能的损害随时间延长加重。第二部分:丰富环境干预对帕金森大鼠中脑BDNF表达的影响[目的]检测丰富环境干预下大鼠中脑BDNF表达的变化,探讨丰富环境治疗PD的可能机制。[方法]将造模成功的6-OHDAPD大鼠随机分成2组:6-OHDA+EE组(7只)、6-OHDA+标准环境(standard environment,SE)组(7 只)。设假手术(sham)+EE 组(6 只)、sham+SE组(6只)。予对应环境干预6周后,以行为学实验评价大鼠行为学改变,以尼氏染色和酪氨酸羟化酶免疫组化染色观察大鼠中脑神经元的变化,以western blotting检测大鼠中脑BDNF的水平。[结果](1)PD模型的筛选:20只大鼠中,成功的PD模型有14只,模型成功率为70%。(2)行为学实验1)阿扑吗啡诱导旋转实验:6-OHDA+EE与6-OHDA+SE组大鼠30分钟旋转总圈数分别为237.00±17.70圈、236.83±14.15圈,两者比较,差异无统计学意义(t=0.019,P>0.05)。sham+EE、sham+SE组均未出现旋转行为。2)旷场实验:四组大鼠的length、dist1、RT1、RT1%、MF1、Vmean1比较,差异具有统计学意义(P<0.05),而 dist2、RT2、RT2%、MF2、Vmean2 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两两比较,6-OHDA+EE组length、dist1、Vmean1小于sham+EE组,差异具有统计学意义(P<0.05),而 RT1、RT1%、MF1、dist2、RT2%、RT2、MF2、Vmean2 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6-OHDA+SE 组 length、dist1、MF1、VMean1 均小于sham+SE组,RT1、RT1%大于sham+SE组,差异均有统计学意义(P<0.05);而两组间dist2、RT2、RT2%、MF2、Vmean2 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6-OHDA+EE组length、distl、Vmeanl大于6-OHDA+SE组,差异有统计学意义(P<0.05),而两组间 RT1、RT1%、MF1、dist2、RT2、RT2%、MF2、VMean2 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。sham+EE、sham+SE在旷场实验的上述各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)尼氏染色sham+EE、sham+SE组大鼠纹状体及黑质神经细胞排列密集,胞浆尼氏体丰富,而6-OHDA+EE、6-OHDA+SE组损伤侧纹状体及黑质神经细胞排列较稀疏,细胞间隙增大,胞浆内尼氏体减少,6-OHDA+EE组与6-OHDA+SE组损伤侧纹状体及黑质细胞形态无明显差异。(4)TH免疫组化染色6-OHDA+SE组大鼠损伤侧纹状体TH阳性纤维光密度、损伤侧黑质TH阳性细胞数小于sham+SE组,差异均有统计学意义(P<0.05)。6-OHDA+EE组损伤侧纹状体TH阳性纤维光密度、损伤侧黑质TH阳性细胞数小于sham+EE组,差异均有统计学意义(P<0.05)。6-OHDA+EE组损伤侧纹状体TH阳性纤维光密度、损伤侧黑质TH阳性细胞数大于6-OHDA+SE组,差异有统计学意义(P<0.05)。sham+SE组损伤侧纹状体TH阳性纤维光密度、损伤侧黑质TH阳性细胞数目小于sham+EE组,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)不同环境干预下各组大鼠中脑BDNF的表达6-OHDA+SE组大鼠损伤侧纹状体、损伤侧黑质BDNF水平低于sham+SE组,差异均有统计学意义(P<0.05)。6-OHDA+EE组损伤侧纹状体、损伤侧黑质BDNF水平低于sham+EE组,差异均有统计学意义(P<0.05)。6-OHDA+EE组损伤侧纹状体、损伤侧黑质BDNF水平高于6-OHDA+SE组,差异有统计学意义(P<0.05)。sham+SE组损伤侧纹状体、损伤侧黑质BDNF水平低于sham+EE组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]丰富环境干预可能通过上调大鼠中脑BDNF表达,改善大鼠运动功能和促进多巴胺能神经元修复,从而实现治疗PD的作用。