前言：　　 喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,在我国,东北地区是喉癌的高发区。过去的10年中,我国喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏感,手术是目前治疗的主要手段,但其局部浸润和转移对临床治疗和预后有着重要影响,是造成喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因,而肿瘤侵袭和转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程,包括肿瘤细胞从原发灶脱落,与基底膜粘着,产生蛋白酶降解细胞外基质,侵入血管或淋巴管,诱导肿瘤血管形成,最终在远处形成转移灶。因此探讨与喉癌转移相关的基因对喉癌的治疗和预后具有重要意义。　　 S100家族蛋白属于钙离子结合蛋白,在分子结构具有高度同源性,它们有共同的EF双螺旋结构的氨基酸基序(手型钙离子结合区),这一基序能够促进其与钙离子高度结合,参与信号转导通路从而调节细胞的生长和分化。作为S100蛋白家族成员,S100A4蛋白通过与钙离子结合在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。人类S100A4基因定位于lq21,编码由101个氨基酸组成的多肽,分子量约为11.7kDa。S100A4参与调节多种细胞内外功能,如细胞生长和新陈代谢,影响细胞骨架形成、改变细胞形状、参与信号传导,调节细胞黏附等。S100A4可作为一种重要的肿瘤调节因子发挥生物学作用,并且与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。研究报道在多种肿瘤组织中S100A4表达升高,如食管癌、胃癌、结肠癌及黑色素瘤等,近来研究发现在乳腺癌中上调S100A4的表达后促进肿瘤细胞转移,而且S100A4阳性表达的乳腺癌患者预后很差。但S100A4参与肿瘤发生和转移的机制仍不十分清楚。基质金属蛋白酶类(Matrixmetalloproteinases,MMPs)是一组锌离子依赖性肽链内切酶,MMPs激活后能够促进肿瘤生长,侵袭和转移,其家族包括21种以上的蛋白酶。其中,MMP-9作为一种92KDA的明胶酶,于1989年首次从人纤维母细胞克隆出来,人MMP-9基因位于染色体20q11.1-13.1。当它激活后能够使胶原蛋白结构发生变形并将其降解,它通过降解细胞外基质和基底膜,从而促进肿瘤侵袭和转移。在正常肺组织中MMP-9极少表达,但是在肺部疾病,如哮喘,肺纤维化,COPD中高表达,亦有研究发现在乳腺癌,结直肠腺瘤和胃癌中MMP-9的表达均比相应的正常组织中增高。它也是作为一种肿瘤促进因子发挥生物学功能。　　 最近有研究发现在前列腺癌PC3细胞系中转染S100A4的表达载体后能够在蛋白水平和mRNA水平上上调MMP-9的表达。所以我们推测在喉癌中S100A4可能调节MMP-9的表达。两者可能在喉的发生发展及淋巴结转移过程中起协同作用。但上述假设是否成立?其具体机制如何?这些问题需要我们进一步研究证实。本研究目的旨在探讨喉组织中S100A4和MMP-9的表达情况及与临床病理学参数的意义。在细胞水平上,通过干扰S100A4,观察其对MMP-9表达的影响。　　 材料与方法：　　 一、材料　　 115例喉组织标本(35例癌旁喉组织和80例喉鳞癌组织),均来自中国医科大学附属第一临床学院2009-2011年耳鼻咽喉头颈外科手术切除的标本,所有患者均为原发,术前均未接受放、化疗。标本经HE常规染色后由两名病理医师明确诊断。其中部分癌旁喉组织(远离肿瘤至少1厘米)和癌组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存,以备Westernblot检测。　　 1株喉癌癌细胞株(Hep-2),用含10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。　　 二、主要试剂和来源　　 S100A4兔单克隆抗体,S100A4siRNA,MMP-9羊单克隆抗体均购自美国SantaCruz公司。Hiperfect转染试剂购自QIAGEN生物公司。SP免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。　　 三、方法　　 1、免疫组织化学染色及结果判定　　 标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm连续切片,采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测S100A4和MMP-9蛋白表达。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定:S100A4和MMP-9蛋白以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(×400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数,按S100A4和MMP-9蛋白表达百分率分为以下四个等级:0%为0分,1%-50%为1分,51%-75%为2分,>75%为3分。根据染色强度分为三个等级:浅黄色计为1分,棕黄色计为2分,黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分,积分<4者判定为阴性,积分≥4为阳性。　　 2、WestemBlot　　 在收集的细胞内加入裂解液充分裂解,低温高速离心(4℃,15000转/min,30min),提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳(10%SDS-PAGE凝胶)、转印至PVDF膜、封闭,一抗S100A4(1:200)、MMP-9(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育过夜,分别与各自对应的二抗(1:4000)室温孵育2小时,ECL显色,结果经自动凝胶成像分析仪采集,进行灰度值测定,β-actin做内参。　　 3、siRNA干扰　　 实验分三组:空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组,每个实验均重复三次,转染具体步骤按Hiperfect试剂说明书进行。　　 四、统计分析　　 应用SPSS13.0统计软件进行数据处理,采用χ2检验分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析S100A4蛋白与MMP-9蛋白表达的关系,采用t检验分析Westernblot图像灰度值,组化积分值,P<0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1、免疫组织化学结果　　 S100A4和MMP-9蛋白主要在细胞浆表达。在喉鳞癌组织中S100A4和MMP-9蛋白的阳性表达率均高于癌旁喉组织。两者表达水平均与喉鳞癌淋巴结转移(P<0.05)明显相关。在喉鳞癌组织中S100A4蛋白表达与MMP-9表达呈正相关(P<0.05)。　　 2、WesternBlot结果　　 S100A4蛋白和MMP-9蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显高于正常喉组织,用S100A4siRNA干扰喉癌细胞系Hep-2中S100A4的功能后MMP-9的蛋白水平较对照组下降。　　 结论：　　 S100A4和MMP-9蛋白在喉鳞癌发生发展和转移中存在异常,并且两者可能存在某种协调关系。