论文部分内容阅读
目的:骨吸收和骨溶解性疾病为骨科和口腔科的治疗带来了巨大挑战,如关节置换,种植体导致的骨吸收,牙周炎导致的骨吸收等。骨吸收活动主要由骨髓系来源的破骨细胞承担。破骨细胞的分化主要依赖于以巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor,M-CSF）为辅助作用的,成骨细胞分泌的核因子受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-B,RANK）及其配体（receptor activator for nuclear factor-B ligand,RANKL）的结合。两者结合后,招募细胞内信号分子,肿瘤坏死因子受体相关因子6,（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）,随后激活细胞内NF-kB信号传导通路,诱导转录因子T细胞的核因子NFATc1（nuclear factor of activated T cells 1,NFATc1）的活化。NFATc1启动下游的调节环路并与其他转录因子合作启动破骨细胞特异性基因的表达。在骨吸收进行时,调控相应的酸性酶如CTSK（cathepsin K,CTSK）以及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）的分泌以吸收骨基质。低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）以其非侵入性脉冲式机械波的特点被熟知,对骨折、骨缺损以及骨关节炎具有治疗和保护作用。无论是通过促进成骨细胞分化还是抗炎保护的作用,其对骨微环境调控的潜在分子机制还仍未阐明。LIPUS可以通过调控相关基因和蛋白的表达,以及表观遗传的修饰激活相关的信号传导通路来影响细胞增殖和分化,以发挥其促进组织再生、抗炎、和免疫调控的作用。由于骨组织的自体修复反应是个复杂的过程,有血源性的免疫细胞以及骨髓源性的间充质干细胞共同参与,经LIPUS处理的骨创伤微环境,其成骨活性和整体骨再生的能力相应被动员,相应的分子机制也需要进一步探索。随着越来越多的研究揭示了表观遗传调控机制在骨稳态调节中发挥的重要生物学作用,转录后调控和修饰逐渐进入了研究人员的视野。M6A（N6-methyladenosine,m6A）修饰是真核生物m RNA最常见的修饰方式,是由在RNA腺苷酸残基N6位置上进行的甲基化修饰。M6A修饰主要由甲基化转移酶复合物写入,包括甲基化转移酶3（methyltransferase like 3,METTL3）、METTL14和WTAP（Human Wilms Tumor 1 Associated Protein,WTAP）;甲基化橡皮擦FTO（Fat and obesity related gene,FTO）和ALKBH5擦除;甲基化阅读器YTH结构域家族的成员来解读m6A修饰信息。作为动态的表观修饰方式,m6A被认为参与到多个方面的m RNA代谢中,包括可变剪切,RNA稳定性,RNA的出核和翻译。在骨微环境中,m6A修饰也同样影响着成骨效应。在破骨细胞分化过程中,m6A修饰水平明显上升。综上所述,本研究拟从RNA修饰的角度探究LIPUS对破骨细胞分化过程中m6A修饰水平的影响以探究LIPUS抑制破骨分化的可能分子机制,以期从表观遗传学的维度揭示LIPUS发挥生物学调控作用的机制,为其在治疗骨吸收性疾病的应用提供证据和支持。研究方法:1、观察加载不加载LIPUS条件下,50ng/m L的RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化的能力。通过抗酒石酸酸性品红染色（Tartrate-resistan acid phosphatase,TRAP）和F-actin荧光染色方法观察破骨细胞分化的数量和大小;通过RT-q PCR法和Western blot法观察破骨细胞分化的标志物CTSK,TRAF6,MMP9,NFATc1,NF-kB1的m RNA和蛋白水平的变化;通过免疫荧光染色观察溶酶体标记物LAMP-1（recombinant lysosomal associated membrane protein 1,LAMP-1）的表达。2、观察加载不加载LIPUS对破骨细胞分化过程中m6A修饰水平的影响。通过间接酶联免疫法测定破骨细胞分化过程中m6A修饰的水平。通过生物信息学预测可与破骨分化关键基因结合的m6A相关酶。筛选LIPUS作用下表达发生明显变化的m6A修饰酶。利用RT-q PCR法和转染法,观察干扰相应m6A修饰酶对的破骨细胞Traf6和Ctsk的m RNA稳定性的影响。3、观察化学法和生物学方法干扰m6A修饰酶的情况下,LIPUS对破骨细胞分化的影响。通过CCK-8法观察对细胞增殖的影响;利用RT-q PCR法、Western blot法和免疫荧光法观察破骨分化标志物m RNA水平,蛋白水平,以及相应骨吸收酶表达的变化。结果:1、在50ng/m L RANKL诱导下,较不加载LIPUS组相比,LIPUS加载组破骨细胞分化的数量和大小均减少,破骨细胞分化标志物Traf6、Ctsk、Mmp9、Nfatc1的m RNA表达明显降低（P<0.05）;TRAF6、CTSK、MMP9、NFATc1和NF-kB1的蛋白达明显降低（P<0.05）;LAMP-1标记的溶酶体数量减少。2、LIPUS能够显著降低破骨分化过程中m6A修饰水平（P<0.05）;LIPUS能够显著上调去甲基化酶FTO的表达（P<0.05）。干扰FTO表达后,破骨分化基因Traf6以及Ctsk的m RNA降解速率延缓（P<0.05）。3、生物学转染si-FTO后,加载与不加载LIPUS的组较相应的转染si-NC组其破骨分化标志物Ctsk、Traf6、Mmp9、Nfact1和Nfkb1的表达均显著上调（P<0.05）。在si-FTO转染组内,LIPUS对破骨分化标志物蛋白表达的抑制作用消失,与未加LIPUS的si-FTO转染组相比,其CTSK和NFATC1显著上升（P<0.05）;对各组m6A修饰水平检测结果显示在LIPUS组转染si-FTO后,其m6A修饰水平较si-NC组上升;但LIPUS组内,转染si-FTO和si-NC其m6A修饰均较RANKL组下调,但其差异无统计学意义。化学方法抑制FTO活性后,FTO抑制组较未抑制FTO组其破骨分化标志物Ctsk,Traf6,Mmp9,Nfatc1和Nfkb1的表达均有所上调（P<0.05）;抑制剂组内,LIPUS处理后,破骨标志物MMP9,CTSK,TRAF6和NFATc1蛋白表达水平略下降,除NFATc1外无统计学差异（P>0.05）。CTSK以及MMP9的免疫荧光结果显示,转染si-FTO或抑制FTO活性后,LIPUS对CTSK以及MMP9表达的抑制作用消失。结论:1、LIPUS能够抑制破骨细胞分化的数量和大小,能够抑制破骨分化标志物TRAF6、CTSK、MMP9、NFATC1和NFkB1的表达。2、LIPUS能够上调去甲基化酶FTO的表达,降低破骨分化过程中的m6A修饰水平。3、FTO参与维持TRAF6以及CTSK的降解速率。4、LIPUS发挥其对破骨细胞分化过程中抑制作用依赖于FTO的表达和活性。