鹦鹉热衣原体检测技术研究及重庆鹦鹉热衣原体流行病学调查

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鹦鹉热衣原体(Chlamyida psittaci)引起的人畜共患病日趋严重,但其诊断尚缺乏准确快速的检测手段。因此迫切需要建立准确、快速的鹦鹉热衣原体PCR和RT-QPCR检测方法。为此,我们利用PCR和RT-QPCR建立了准确、快速的检测方法,研制出鹦鹉热衣原体PCR检测试剂盒;利用建立的定量PCR检测初步探索了鹦鹉热衣原体感染同检测间的量化关系;并利用建立的PCR方法同IHA方法对比进行流行病学调查。本研究主要获得以下研究结果:①鹦鹉热衣原体PCR检测方法的建立。利用NCBI上公布的鸟源主要外膜蛋白MOMP基因序列(PSITTACI 457203)设计引物,利用鸭源CS1 DNA为模板,通过优化反应体系,得到100 bp的目标检测片段,建立了鹦鹉热衣原体的PCR检测方法,灵敏度可以达到2.5×10-5 ng/μl模板量,构建了鹦鹉热衣原体PCR检测试剂盒。②鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法的建立。将PCR扩增得到的目标片段作为Real-time quantitative PCR的模板和阳性对照,利用两种定量PCR仪分别建立了鹦鹉热衣原体定量PCR反应体系。所建立的Real-time quantitative PCR检测方法,在模板浓度范围1.78×102-1.78×108拷贝/μl时,其线性相关系数达到0.998;融解曲线只有唯一的峰值,Tm值为79.1℃;批内和批间变异系数(CV%)分别为1.30-4.59%和5.72-9.87%。③利用建立的鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法进行小白鼠感染的量化分析试验。通过对随机分成的7组,每组12只的小白鼠,一组为对照组,其他各组同时腹腔注射Cps菌液,每天进行1次抽样检测,监控小白鼠感染后的体内Cps量的变化关系,初步探索了动物CPS感染和Real-time quantitative PCR检测的量化关系。④对重庆市6个区县不同养殖环境下的禽类随机采集血清样品400份和相对应的组织样品430份,利用IHA诊断试剂盒初步检测筛选出可疑样品,然后利用本研究构建的鹦鹉热衣原体PCR反应体系对可疑样品进行进一步检测。对IHA检测出的157分阳性血清所对应的157份组织样品进行PCR检测,共检出146份样品呈阳性,检出样品的阳性率为93.0%,结果表明所建立的鹦鹉热衣原体PCR检测方法的特异性和稳定性均较好。
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