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早期断奶是仔猪生长过程中重大的创伤性事件,断奶应激和饲粮的改变引起肠道功能紊乱、肠道内微生态环境失衡和生长受阻,乳源生长因子的缺乏是引起肠道发育受阻的主要原因之一。表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)是调节细胞增殖、分化、代谢、存活、凋亡等的一种重要生长因子,是初乳和常乳中最重要的生长因子之一。已有研究表明食品级乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)的NICE表达系统在外源蛋白的表达中性能优越。本研究旨在通过乳酸乳球菌作为载体构建表达功能蛋白猪EGF (pEGF),获得具有生物学活性的重组pEGF,并探索乳酸乳球菌和特异性功能蛋白pEGF的双重效应结合在早期断奶仔猪生产中应用的可行性。本研究包括以下三部分：试验一猪表皮生长因子(pEGF)成熟蛋白编码区的克隆及序列分析本试验通过克隆猪egf基因成熟肽编码序列,并与USP45蛋白的信号肽编码序列形成融合片段,通过TA克隆获得pMD19-SPUsp45-MPpEGF质粒,经过菌液PCR分析、双酶切鉴定和测序鉴定USP45蛋白的信号肽编码序列和pegf基因成熟肽编码序列。试验结果表明成功克隆猪egf基因成熟肽编码序列,并构建了pMD19-SPUsp45-MPpEGF质粒。试验二重组pEGF在乳酸乳球菌NZ9000中的表达分泌及活性研究试验一获得的质粒经过双酶切,获得SPUsp45+MPpEGF片段,该片段与含相同酶切位点的表达质粒pNZ8148连接获得目标质粒pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF。该质粒转化至Ecoli MC1061感受态细胞并经PCR分析和质粒测序鉴定其序列的正确性。随后提取E. coli MC1061中的pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF质粒通过电转化转至乳酸乳球菌NZ9000中(L. lactis NZ9000)并进行筛选鉴定,获得L. lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF分泌表达系统。通过1ng/mL终浓度nisin诱导pEGF分泌表达,采用western blot方法检测pEGF的分泌表达,并通过体外培养小鼠成纤维细胞CCL-1L929,添加L.lactis NZ9000/pNZ8148-Usp45-MPpEGF重组菌诱导分泌表达蛋白pEGF,考察重组pEGF对成纤维细胞增殖分化的影响,从而检测分泌蛋白的生物学活性。试验结果表明：1.成功构建了乳酸乳球菌分泌表达体系L. lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF。2. L.lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF经nisin诱导后表达pEGF,且培养液和菌体中均有pEGF的表达,而未诱导的菌体、菌液中无pEGF表达；nisin诱导后,随着时间的延长pEGF分泌量呈现增加趋势,诱导12h后分泌量趋于稳定,诱导24h后pEGF的分泌表达量可达1000ng/mL。3.添加nisin诱导NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MpEGF (LL-pEGF)上清液组显著提高小鼠成纤维细胞CCL-1L929细胞的密度；细胞计数结果发现不同上清液处理24h后,人重组EGF处理组(rhEGF,10ng/mL)和LL-pEGF (20μL)处理组细胞数高于空载体对照组(LL-EV,20pL)(P<0.05); LL-pEGF (40μL)处理组细胞数极显著高于LL-EV (20μL)处理组(P<0.01)；而rhEGF、LL-pEGF (20μL)和LL-pEGF(40μL)处理组细胞数差异不显著(P>0.05),但LL-pEGF促进细胞增殖能力有高于rhEGF的趋势,表明添加重组pEGF和rhEGF同样能有效刺激小鼠CCL-1L929细胞增殖；通过BrdU标记法检测乳酸乳球菌分泌的重组pEGF对小鼠CCL-1L929细胞的有丝分裂结果发现,rhEGF (10ng/mL)(20.16±2.59%), LL-pEGF (20∴L)(25.01±2.98%)和LL-pEGF (40μL)(25.37±1.26%)处理组BrdU细胞数极显著高于LL-EV (20μL)(11.57±1.19%)处理组(P<0.01)；而rhEGF, LL-pEGF (20μL)和LL-pEGF (40μL)处理组BrdU细胞数差异不显著(P>0.05), LL-pEGF处理组促进细胞增殖能力有高于rhEGF组的趋势,但差异不显著(P>0.05)。由此表明本研究中的乳酸乳球菌经nisin诱导后可高效分泌表达重组pEGF,且该pEGF具有生物学活性。试验三基因重组pEGF乳酸乳球菌对断奶仔猪肠道健康的影响本试验拟通过胃内灌注试验二获得的pEGF基因重组L. lactis经nisin诱导后的全培养液(LL-pEGF),研究对早期断奶仔猪断奶生长性能,肠道发育包括形态结构、消化道酶活和微生物菌群的影响,同时设计对照组(空白对照组),抗生素对照组,空载体L. lactis培养液对照组(LL-EV),研究在无抗生素日粮中添加pEGF基因重组L. lactis替代抗生素的可能性。试验结果表明：1. LL-pEGF处理组显著提高断奶仔猪第1周和全期的平均日增重(ADG, P<0.05)。而对日均采食量(ADFI)的影响各组差异不显著(P>0.05)。LL-pEGF处理组有降低料肉比的趋势但差异未达显著水平(P>0.05)。2. LL-pEGF处理组较对照组可显著提高仔猪十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度(P<0.05)。LL-pEGF处理组回肠绒毛高度显著高于LL-EV处理组(P<0.05),抗生素处理组回肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05)。对隐窝深度的影响各处理组间差异不显著(P>0.05)。3.各处理组各肠段乳糖酶的活性差异不显著(P>0.05)。LL-pEGF处理组较对照组显著提高了蔗糖酶在十二指肠、空肠和回肠中的活性(P<0.05)。LL-pEGF处理组较抗生素组和LL-EV组显著提高了回肠中的麦芽糖酶活性(P<0.05),而在十二指肠和空肠中各处理对麦芽糖酶活性的影响差异不显著(P>0.05)。LL-pEGF处理组较对照组和抗生素组显著提高了氨肽酶A,氨肽酶N和二肽酶Ⅳ在十二指肠中的活性(P<0.05)。LL-pEGF处理较对照组和LL-EV处理组显著提高了APA在空肠中的活性(P<0.05)。4. LL-pEGF处理组和抗生素组回肠大肠杆菌数显著低于对照组和LL-EV处理组(P<0.05)。LL-pEGF和抗生素处理后均有降低回肠肠球菌数量的趋势,但差异不显著(P>0.05)。各处理对回肠双歧杆菌的影响差异不显著(P>0.05)。LL-pEGF组较对照组和抗生素组显著提高了断奶仔猪回肠乳酸菌的数量(P<0.05)。与对照组和LL-EV处理组相比,抗生素组显著降低了盲肠中大肠杆菌数(P<0.05),而LL-pEGF处理组有降低盲肠中大肠杆菌的数量的趋势但差异未达显著水平(P>0.05)。各处理组对盲肠中肠球菌和双歧杆菌数的影响差异不显著(P>0.05)。LL-pEGF处理组较对照组和抗生素组极显著提高了盲肠乳酸菌的数量(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了外源高效分泌表达pEGF蛋白的基因工程菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF,通过体外细胞试验表明pEGF具有刺激细胞增殖活性的作用,早期断奶仔猪的体内试验表明重组pEGF乳酸乳球菌L. lactis NZ9000可通过促进肠上皮细胞发育,改善肠上皮消化酶分泌,调节肠道微生态平衡从而改善断奶仔猪肠道健康,提高生产性能。