【摘 要】
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我国土壤重金属污染问题日益严峻,研究重金属抗性基因的功能机制,用于培育镉(Cd)高抗新种质,对于提高土壤重金属污染的植物修复效率具有重要的意义。超积累型(hyperaccumulation
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我国土壤重金属污染问题日益严峻,研究重金属抗性基因的功能机制,用于培育镉(Cd)高抗新种质,对于提高土壤重金属污染的植物修复效率具有重要的意义。超积累型(hyperaccumulation ecotype,HE)东南景天(Sedum alfredii Hance)是我国特有的锌-镉超富集植物,其在地上部分可以积累9,000μg g-1 Cd和29,000μg g-1 Zn而不呈现任何毒性症状,极具研究价值。为了解析超积累型东南景天的高抗及超积累能力,研究者对参与离子转运、螯合及氧化损失修复等进程的基因开展研究。然而,镉离子作为胁迫信号在胞内诱发何种信号通路,激活何种转录因子,调控哪些镉胁迫响应基因应对胞内离子稳态和环境的改变,依然是需要深入探索的领域。富含亮氨酸的结构域(Leucine-Rich Repeats,LRRs)是重要的配基识别结构,含有LRR类结构的蛋白在植物生长发育等进程发挥重要作用,其中富含亮氨酸重复的类受体蛋白激酶(Leucine Rich Repeat Receptor Like Kinases,LRR-RLKs)是植物信号转导的重要调控分子,DNA-damage repair/tolerane 100(DRT100)则与DNA损伤修复密切相关。而在超积累型东南景天中,LRR-RLKs基因家族成员是否调控Cd胁迫信号传递目前以及DRT100是否与镉耐性相关是本论文拟解决的问题。本研究首先对超积累型东南景天的LRR-RLKs基因家族开展生物信息学分析,并研究了其在Cd胁迫下的应答模式,发现Sa0F.522,Sa0F.1036,Sa28F.115可能在调控镉信号传递中发挥重要作用,并对Sa0F.522在酵母中进行初步的功能分析。其次,开展了超积累型东南景天的SaDRT100的功能研究,发现该基因定位于细胞核中并在地上部分表达量丰富,该基因的超表达能够提高酵母转化子及转基因拟南芥的镉抗性,证实其参与了超积累型东南景天的Cd镉耐性。主要研究结果如下:在超积累型景天中共鉴定了60个LRR-RLK基因,它们被分为10个亚类,每个亚类成员间具有高度保守的蛋白质结构域和基序排布。镉处理24h后,LRR-RLK家族基因中有17个基因在根部上调表达,主要分布于III和XII亚类;26个基因在茎中上调表达,主要分布于XII亚类;26个基因在叶中表达量上调,主要分布于III,VII和XII亚类。权重基因共表达网络分析显示Sa0F.522,Sa0F.1036,Sa28F.115以及Sa1F.472等十个中心基因(hub基因)与其他参与金属转运、响应刺激和转录调控的基因密切相关。Cd处理20min内这10个hub基因的响应模式存在差异,其中Sa0F.522,Sa0F.1036,Sa28F.115在东南景天根、茎和叶中均呈上调表达。将Sa0F.522基因在酵母中进行异源表达,结构发现Sa0F.522增加了转基因酵母的Cd敏感性,为该基因有可能参与调控Cd胁迫信号传递提供支持。为了解析SaDRT100的功能,首先对其镉胁迫表达模式开展研究,结果显示SaDRT100呈现组织表达偏好性,且其表达受Cd胁迫调控。亚细胞定位结果显示SaDRT100定位于细胞核中。将SaDRT100基因在镉敏感酵母菌株(Δycf1)中进行异源表达,结果显示该基因的表达可以显著提高镉敏感型酵母在含镉培养基上的存活率。将该基因在模式植物拟南芥中进行超表达,研究转基因拟南芥镉抗性的变化。幼苗镉胁迫实验显示SaDRT100转基因拟南芥在含镉培养基上其根长及生物量显著高于野生型;拟南芥成苗镉胁迫实验果显示SaDRT100转基因拟南芥的叶绿素、电导率等生理指标优于野生型,活性氧(Reactive oxygen,ROS)的积累水平显著降低,并在根部限制了镉离子的吸收。上述研究解析了超积累型东南景天SaDRT100的组织定位、镉胁迫应答模式,揭示了其耐镉性新功能,为培育镉高抗新种质提供理论支持和技术指导。
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