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成体干细胞（Adult Stem Cells,ASCs）是成体组织中具有自我更新的能力并可产生分化的子细胞以维持组织稳态的一类细胞。这种稳态不仅可被干细胞的内源因子调节,也可被干细胞微环境中的外源因子调控。如果没有干细胞,组织会因为没有新成体细胞的补充而退化。生殖干细胞（Germline Stem Cells,GSCs）作为ASCs的一个重要成员,扮演着十分重要的角色,关乎着种族的繁衍生息。果蝇（Drosophila melanogaster）作为经典模式生物,其卵巢成为研究生殖干细胞最好的模型系统之一。果蝇Hsc70-4基因属于热休克蛋白70家族,编码热休克蛋白Hsc70-4,研究表明,Hsc70-4热休克蛋白参与调控多种生物学过程,如细胞对刺激的反应、伴侣蛋白介导的蛋白质折叠、对拓扑不正确的蛋白质的反应、转录后调控基因的表达、神经递质的分泌、囊泡介导的运输等。通过前期的研究,我们发现:在果蝇卵巢中特异敲低Hsc70-4基因会使卵巢中生殖干细胞数量严重缺失,卵巢体积变小。因此,我们设计实验,借助实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色、基因工程技术、转基因显微注射及FLP/FRT有丝分裂重组等技术,研究Hsc70-4基因调控生殖干细胞命运的初步机制。首先,利用实时荧光定量PCR技术探究Hsc70-4基因在果蝇各组织中的表达量情况。实验选取了野生型果蝇Oregon的8种组织:全身、头、肠、马氏管、脂肪体、肌肉、卵巢以及精巢。结果显示,Hsc70-4基因在果蝇各组织中均有表达,在果蝇卵巢中Hsc70-4基因表达量处于较高水平。为探究Hsc70-4基因是否影响果蝇卵巢的发育,订购两组Hsc70-4 RNA干扰（RNA interfering,RNAi）品系:位于2号的P{TRi P.HMJ21529}att P40和位于3号的P{y[+t7.7]v[+t1.8]=TRi P.GLV21049}att P2,运用UAS-gal4系统,分别下调果蝇卵巢中Hsc70-4基因的表达。结果发现,羽化1d后野生型的果蝇卵巢表现为饱满、卵管发育正常且存在胚胎,而两组Hsc70-4基因表达下调果蝇的卵巢均出现卵巢异常:卵巢大小明显变小、卵管萎缩且卵巢中没有胚胎。这些现象初步暗示了Hsc70-4基因对卵巢的发育存在影响。为揭示Hsc70-4基因表达下调导致卵巢变小的原因,通过遗传杂交实验将两组Hsc70-4 RNA干扰品系分别与内源性工具株果蝇（nos-GVP）和外源性工具株果蝇（c587-gal4）杂交,得到内源性或外源性敲低Hsc70-4基因的果蝇,利用免疫组织化学染色技术,研究羽化后不同天数它们卵巢中GSC（生殖干细胞）的数量变化。结果显示:野生型果蝇对照组以及两组Hsc70-4 RNA干扰品系亲本对照组,在羽化14天后正常原卵区的比例均在95%以上,而两组Hsc70-4内源性敲低组果蝇在羽化1d后卵巢中的GSC就出现严重的丢失,正常原卵区的比例降为0,表明Hsc70-4基因内源性表达下调严重影响了果蝇卵巢GSC的维持。两组外源性敲低Hsc70-4基因的果蝇在羽化14d后正常原卵区的比例仍为94.2%和98.4%,与对照组相比无显著差异,表明Hsc70-4基因外源性表达下调不影响果蝇卵巢中GSC的维持。上述结果预示着Hsc70-4基因内源性调控卵巢生殖干细胞的命运。为了确证两组内源性敲低Hsc70-4基因的果蝇品系,它们的Hsc70-4基因表达与它们卵巢中GSC的维持存在正相关性,利用荧光定量PCR技术,从m RNA水平检测两组内源性敲低Hsc70-4基因果蝇品系的卵巢中Hsc70-4基因的相对表达量。q PCR结果显示,两组内源性下调组中Hsc70-4基因的表达量与野生型相比分别下降了1.4倍和2.6倍,均存在显著降低。结果证明了果蝇卵巢中Hsc70-4基因内源性表达下调直接导致了生殖干细胞的丢失。为进一步证明Hsc70-4基因内源性调控生殖干细胞的命运,采用FLP/FRT有丝分裂重组技术诱导出Hsc70-4基因内源性突变的GSC克隆,统计1d、7d、14d被GFP阴性标记的GSC克隆数的数量变化。结果显示:14天后,对照组FRT82B被GFP阴性标记的GSC克隆数百分比与第一天相比基本持平,维持在41.9%,而两个实验组(FRT82B,Hsc70-4[L3929]和FRT82B,Hsc70-4[03550])中Hsc70-4基因突变细胞标记的GSC百分比呈下降趋势,FRT82B,Hsc70-4[L3929]实验组14天后下降了20.7%,FRT82B,Hsc70-4[03550]实验组标记的GSC数目更是严重丢失,14天后,标记的GSC数百分比仅为5.2%。实验结果表明Hsc70-4基因内源性缺失也会造成卵巢GSC的丢失,证明了Hsc70-4基因在调控果蝇卵巢生殖干细胞维持方面发挥内源性作用。为了排除遗传背景的干扰,采用遗传互补实验来确证Hsc70-4基因的功能。本课题构建了一系列Hsc70-4转基因载体,接着制备出相关的Hsc70-4转基因果蝇。然后通过遗传杂交,在Hsc70-4内源性敲低或者突变的背景下补充Hsc70-4基因,对Hsc70-4内源性敲低或者突变导致GSC丢失的表型进行挽救。首先从全身性（Hsc70-4P-Hsc70-4转基因果蝇）、直接内源性（nos P-Hsc70-4转基因果蝇）以及诱导内源性（UASP-Hsc70-4转基因果蝇）三个层面,对Hsc70-4基因的敲低表型进行挽救。然后,对于Hsc70-4基因内源性突变表型则利用nos P-Hsc70-4转基因果蝇进行挽救。挽救结果显示:Hsc70-4基因内源性敲低造成的果蝇原卵区内无GSC的表型在挽救后,GSC数量有了显著提升;Hsc70-4基因内源性突变细胞标记的GSC比例也恢复到正常水平。总之,上述结果充分证明了Hsc70-4基因内源性调控着生殖干细胞的命运。再次,借助Hsc70-4P-GFP转基因果蝇,验证Hsc70-4基因在果蝇卵巢中的表达模式,借助免疫组织化学染色技术,观察果蝇卵巢中Hsc70-4基因的表达模式。结果显示,Hsc70-4基因在果蝇卵巢的内、外源环境中均有表达。上述实验结果,Hsc70-4基因仅仅发挥着内源性的调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的功能。既然Hsc70-4基因敲低或突变均造成GSC数量的丢失,那么丢失的GSC是否提前走向分化?为了验证这一推测,在卵巢中过表达Hsc70-4基因,观察是否会延迟GSC和CB（包囊母细胞）的分化。从内源性（nos P-Hsc70-4/nos P-Hsc70-4基因型果蝇）、诱导内源性（UASP-Hsc70-4/UASP-Hsc70-4;nos-GVP/nos-GVP基因型果蝇）、热激型（hs P-Hsc70-4/hs P-Hsc70-4基因型果蝇）三个方面过表达Hsc70-4基因,统计果蝇卵巢原卵区中包含“spectrosome-containing”细胞（GSC和CB数目的总和）的数量。实验结果发现,三组过表达组中“spectrosome”细胞的平均数分别为6.90、6.49和6.30,而野生型Oregon平均数仅仅为3.28,存在显著增加。上述结果表明,过表达Hsc70-4基因可以有效地延迟GSC和CB的分化,Hsc70-4基因敲低或者突变造成的GSC数量的丢失很可能是因为GSC走向了分化。综合上述研究结果表明:Hsc70-4基因在果蝇各组织中特异性表达,在果蝇卵巢中内外源均有表达,但Hsc70-4基因只内源性调控果蝇卵巢生殖干细胞的命运,Hsc70-4基因的敲低或者突变会造成GSC无法自我更新,分化出现失衡,从而促使GSC无法维持,提前走向分化。