目的:本实验研究了特立氟胺(teriflunomide,TIF)联合白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠,多发性硬化(multiple sclerosis,MS)的动物模型的保护作用。通过对EAE小鼠行为学观察以及对脊髓腰膨大进行HE染色,LFB染色以及电镜观察,探索特立氟胺与白芍总苷联用对EAE小鼠的治疗作用,为联合用药治疗多发性硬化提供新思路。方法:1选用50只8-10周龄的、健康的、雌性、体重约为18g-20g的C57BL/6小鼠。将其随机分为5组:Control组、EAE组、特立氟胺组、白芍总苷组及特立氟胺与白芍总苷联合用药组,每组小鼠10只。EAE组、特立氟胺组、白芍总苷组及特立氟胺加白芍总苷组使用MOG35-55合成多肽作为抗原,以结核菌素、完全弗氏佐剂及百日咳毒素为辅剂,建立小鼠EAE模型,Control组不予免疫。免疫当天记为第0天,自免疫第1天开始给予药物治疗,即特立氟胺组15mg/kg TIF,白芍总苷组500mg/kg TGP,联合用药组特立氟胺、白芍总苷分别为15mg/kg、500mg/kg,正常对照组和EAE组小鼠每日灌服等体积的1.5%的羧甲基纤维素钠。从免疫第1天起,采用双盲法每日早晚(8:00和16:00)各一次,由两名不同观察者分别对小鼠进行称重,同时进行神经功能评分直到处死。神经功能评分采用Weaver(15分)法,观察并记录小鼠发病情况及病程。2选用40只8-10周龄的、健康的、雌性、体重约为18g-20g的C57BL/6小鼠。将其随机分为5组:Control组、EAE组、特立氟胺组、白芍总苷组及特立氟胺加白芍总苷组,每组小鼠8只。EAE组、特立氟胺组、白芍总苷组及特立氟胺加白芍总苷组使用MOG35-55合成多肽作为抗原,以结核菌素、完全弗氏佐剂及百日咳毒素为辅剂,建立小鼠EAE模型,Control组不予免疫。免疫当天记为第0天,自免疫第1天开始开始药物治疗,即特立氟胺组15mg/kg,白芍总苷组500mg/kg,联合用药组特立氟胺、白芍总苷分别为15mg/kg、500mg/kg,正常对照组和EAE组小鼠每日灌服等体积1.5%的羧甲基纤维素钠。各组小鼠分别于26天取材每组5只。取小鼠脊髓,固定,取脊髓腰膨大处组织进行石蜡包埋,分别通过HE染色观察脊髓病变部位炎性浸润程度,罗克沙尔坚牢蓝(Luxol Fast Blue,LFB)特殊髓鞘染色观察髓鞘脱失情况;另每组各取3只做灌注以备电镜观察。通过上述方法观察各药物及药物之间的联合对于小鼠病变部位炎症细胞及髓鞘脱失情况。应用SPSS 21.0软件进行统计学分析,结果如为计量资料则用均数±标准差(X±S)表示;若满足正态分布,多组计量资料均数的比较则采用ANOVA方差分析;若不满足正态分布或方差齐性,则采用秩和检验的方法,P<0.05表明差异有统计学意义。结果:1 Control组小鼠不发病;其他各组发病率分别为:EAE组100%,TIF组90%,TGP组80%,联合用药组30%。各组小鼠发病时间比较:TGP+TIF组、TGP组、TIF组与EAE组小鼠相比,发病时间晚(P<0.05)。TGP+TIF组比TIF或TGP单独用药组发病晚,均具有统计学差异(P<0.05)。但TGP组与TIF组之间发病时间无统计学差异(P>0.05)。2 HE染色:正常对照组脊髓切面结构清晰,未见明显炎症细胞浸润;TGP+TIF组、TGP组、TIF组及EAE组均出现不同程度的髓鞘脱失。其中EAE组最明显,在脊髓灰白质交界处、白质、灰质、脊髓膜及中央管附近均有不同程度炎症细胞浸润,并可见明显的“血管袖套”现象。与EAE组比,用药组小鼠脊髓组织中的炎性细胞浸润数明显减轻,炎性细胞主要集中于小血管周围,并有统计学差异(P<0.05);TGP+TIF组比TIF或TGP单独组小鼠脊髓组织中的炎性细胞浸润数明显减少,并有统计学差异(P<0.05)。但TGP组与TIF组之间小鼠脊髓组织中的炎性细胞浸润数无差异,并无统计学差异(P>0.05)。3 LFB染色:正常对照组脊髓切面无明显髓鞘脱失。各用药组及模型组均存在着不同程度的髓鞘脱失现象,大多数位于白质内的炎症反应灶周围。EAE组小鼠脊髓内可见大小不等的片状髓鞘脱失区域,病变分散,大多出现在前、后角周围的白质,蓝色的髓鞘染色部位变少,颜色变浅,髓鞘脱失区域甚至出现了大片状气球样空泡变性;髓鞘脱失部位常伴随着大片炎症细胞浸润,表明髓鞘脱失和炎症浸润有一定关系;TGP组与TIF组均可见不同程度髓鞘脱失,大部分位于脊髓前后角周围内白质,但比EAE组轻(P<0.05)。联合用药组可见一些部分髓鞘变薄,颜色变浅,存在一些小的髓鞘脱失区,但没有形成大片状髓鞘脱失区域,病灶散在成点灶状。与其他两组相比,髓鞘脱失带非常小,且具有统计学差异(P<0.05)。但TIF与TGP组之间差异不大(P>0.05)。4透射电镜:正常对照组小鼠脊髓结构完整。腰膨大部位白质髓鞘无明显异常。髓鞘呈规则同心圆形紧密排列。EAE小鼠位于腰膨大部位白质稀疏,髓鞘结构松散,可见髓鞘崩解、断裂、脱失。各用药组小鼠腰膨大部位白质结构比较完整,排列尚成规则的同心圆状,未见明显的髓鞘崩解与脱失;且联合用药组髓鞘脱失相对较轻。结论:1特立氟胺联合白芍总苷能够推迟EAE小鼠的发病时间,降低小鼠神经功能损伤,对EAE起神经保护作用,且作用优于单药。2特立氟胺联合白芍总苷可明显减轻EAE小鼠脊髓炎症细胞浸润及髓鞘脱失。