论文部分内容阅读
[目的]1、观察MTX治疗前后RA患者及正常对照T细胞亚群的极化状态，探讨MTX对RA患者T细胞亚群极化状态的调节作用。
2、观察MTX治疗前后RA患者及正常对照炎症因子和抗炎因子的含量，探讨MTX对RA患者炎症因子和抗炎因子生成的调节作用。
3、观察MTX治疗前后RA患者及正常对照淋巴细胞凋亡状况及可溶性凋亡蛋白的含量，探讨MTX对RA患者淋巴细胞凋亡的调节作用。
4、观察MTX治疗前后RA患者及正常对照体液免疫功能的变化，探讨MTX对RA患者体液免疫功能的调节作用。
[方法]1、外周血单个核细胞的分离和培养无菌采集RA患者MTX治疗前和恢复期、正常对照外周静脉血2ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞(Peripheralbloodmonoeuclearcell，PBMC)。加入0.85％Tris-NH4Cl溶液溶解红细胞，无Ca2+、Mg2+Hanks溶液1000r·min-1洗3次，每次离心10min。然后用含20％小牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度约2×106/ml。
取500μlPBMC悬液接种于96孔培养板中，加入PMA(25mg/L)、ionomycin(1mg/L)、monensin(2mg/L)，在37℃、50ml/LCO2培养箱中刺激培养6h。每孔加入DNA酶I(40mg/L)，用橡皮棒刮下各孔细胞，置5ml专用试管中，37℃作用5min，使细胞分散。20％的小牛血清RPMI-1640培养液洗涤2次，并调整细胞浓度约2×106。
2、T细胞亚群极化状态的测定anti-CD3-PE/anti-CD8-Cy5/anti-IFN-γ-FITC和anti-CD3-PE/anti-CD8-Cy5/anti-IL-4-FITC作三色流式细胞术，以CD3/CD8设门、ELISA法检测外周血炎症因子IL-6及抗炎因子IL-10的含量取RA患者治疗前、MTX治疗恢复期和正常对照外周静脉血2ml，常规方法分离血清，按ELISA法IL-6、IL-10试剂盒说明书操作程序检测IL-6和IL-10含量。
4、实时荧光定量PCR法检测外周血IL-6及IL-10的mRNA水平抽提RA患者治疗前、MTX治疗恢复期和正常对照抗凝全血白细胞总RNA，逆转录生成cDNA，设计IL-6、IL-10特异性引物和荧光标记探针，作实时荧光定量PCR，分析IL-6、IL-10的mRNA水平。
5、外周血T、B细胞凋亡的检测取RA患者MTX治疗前、恢复期和正常对照外周血单个核细胞，加入AnnexinV-FITC及PI染液，anti-CD3-PE和anti-CD19-PE。以CD3设门检测T细胞凋亡率，以CD19设门检测B细胞凋亡率。
6、ELISA法检测血清sFas、sFasL含量取RA患者治疗前、MTX治疗恢复期和正常对照外周静脉血2ml，常规方法分离血清，按ELISA法sFas、sFasL试剂盒说明书操作程序检测sFas、sFasL含量。
7、速率散射比浊法检测外周血类风湿因子的含量取RA患者治疗前、MTX治疗恢复期和正常对照外周静脉血2ml，常规方法分离血清，按速率散射比浊法RF试剂盒说明书操作程序检测RF含量。
8、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法检测B细胞活化增殖能力分离外周血淋巴细胞，加入葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA，SPA)。置5％CO2，37℃培养24h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR20μl,使其终浓度为0.5μci/50μl。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。玻璃纤维滤纸干燥后，移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。
[结果]1、RA患者外周血T细胞亚群极化状态异常，CD4+T百分率及CD4+/CD8+比例均明显升高，并且呈Th1/Tc1型细胞优势；MTX治疗后，T细胞亚群极化状态趋于正常。
2、RA患者外周血炎症因子IL-6和抗炎因子IL-10含量显著升高；MTX治疗后，IL-6含量显著降低，IL-10含量继续升高。
3、RA患者外周血T、B细胞凋亡不足；MTX治疗后T、B细胞凋亡率趋于正常。
4、RA患者外周血sFas含量明显升高，sFasL含量则显著高于正常；MTX治疗后sFas、sFasL含量趋于正常。
5、RA患者外周血B细胞活化增殖能力显著升高；MTX治疗后B细胞活化增殖能力趋于正常。
[结论]1、RA是Th1/Tc1型细胞占优势的自身免疫病；MTX能有效恢复RA患者外周血T细胞亚群的平衡状态，使RA病情显著好转。
2、RA患者IL-6含量增多，IL-10含量相对不足；MTX能降低RA患者促炎症因子IL-6的含量，并增加抗炎症因子IL-10的含量。
3、RA患者外周血可溶性凋亡蛋白增多，T、B细胞凋亡不足；MTX可降低RA患者sFas、sFasL含量，并促进T、B细胞的凋亡。
4、RA患者外周血B细胞活化增殖能力增强，类风湿因子RF含量增多；MTX能明显降低RA患者B细胞活化增殖能力，并减少RF的产生。