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L-谷氨酸氧化酶是一种黄素蛋白酶类,能专一性地催化L-谷氨酸或者L-谷氨酸钠,生成α-酮戊二酸、氨和H2O2,反应条件温和,不需要任何的辅因子,反应立体异构专一性强。反应过程中产生的过氧化氢电解可以产生微弱的电子流动,因此常被制成生物传感器应用于疾病研究、食品安全检测、发酵工艺等各个方面。近半个世纪以来,科研工作者们对于L-谷氨酸氧化酶的研究,主要集中在野生型的产谷氨酸氧化酶的菌株筛选、诱导条件优化、提纯工艺简化等方面,对于谷氨酸氧化酶的异源表达以及应用方面研究相对滞后。L-氨基酸氧化酶与L-谷氨酸氧化酶一样,也是一种黄素蛋白酶类,具有FAD或FMN结合亚基,能催化L-氨基酸的氧化脱氨,生成α-酮酸、氨和H2O2。它对底物L-谷氨酸的催化反应机理与L-谷氨酸氧化酶基本相同,但是对各自的功能研究侧重点大不同。L-氨基酸氧化酶广泛分布在各种生物体中,但是对于L-氨基酸氧化酶研究最多的还是集中在收集相对较容易的蛇毒中的L-氨基酸氧化酶。大部分的文章都只报道了各种L-氨基酸氧化酶的溶血、抗细菌、抗病毒、抑癌以及诱导细胞凋亡的作用。因其氧化过程也产生H2O2,并且L-氨基酸氧化酶也具有反应立体异构专一性,所以也有文章报道利用L-氨基酸氧化酶催化底物L-苯丙氨酸产生相应的酮酸,氨和H202来制备手性电极。鉴于L-氨基酸氧化酶的诸多功能,近十年来,越来越多的研究者开始对各种来源的L-氨基酸氧化酶进行了克隆和异源表达,并挖掘重组酶的功能。本研究以L-谷氨酸氧化酶和L-氨基酸氧化酶为研究对象,分别合成和克隆了二种来源的酶基因,继而在大肠杆菌和酵母细胞中实现了高效表达,并进行了活性表征分析,同时优化了谷氨酸（盐）到α-酮戊二酸的反应条件;除此之外,还将2个酶进行了固定化研究,在酵母细胞壁上进行了展示,并且利用固定化技术制备了检测酶膜,在生物传感器仪器上成功实现了对酱油中谷氨酸浓度的测定,现分述如下:1.L-谷氨酸氧化酶基因lgox的克隆,表达和表征本研究合成了加纳链霉菌（Streptomyces ghanaeni ATCC 14672）来源的L-谷氨酸氧化酶基因（GenBank:EFE71695.1）,首先将该蛋白在大肠杆菌中进行了表达和活性表征。IPTG诱导后,重组酶绝大多数以可溶性的形式存在于上清中,酶的最适反应温度和pH分别是30℃和6,在30和40℃热稳定性较好,2 mmol/L的Mg2+能够提高该酶15%的相对活性;然后我们又将该酶在毕赤酵母中进行了表达,这里利用pHBM905BDM载体在体外实现了该基因多拷贝数质粒的构建并且电转化毕赤酵母,摇瓶实验结果表明多拷贝菌株的酶活相对于单拷贝有了大幅提高,多拷贝表达菌株P-LGOX2、P-LGOX3和P-LGOX4的发酵上清中LGOX的酶活水平分别是单拷贝表达菌株P-LGOX1的1.75,2.41和2.75倍;后面采用4拷贝的重组菌株进行了高密度发酵实验,分别尝试了 2种补料发酵工艺DO-stat和指数补料,采用DO-stat补料工艺,发酵结束时发酵结束时菌体湿重和酶活性最高分别达到386 g/L和150.1 U/mL,采用甘油和甲醇指数补料工艺,发酵结束时总酶活和单位生产效率最终达到247.8 U/mL和2581 U/L/h,相比于摇瓶均有了很大的提高。然后将毕赤酵母表达的重组酶进行了活性表征,酶的最适反应温度和pH分别是40℃和6.5,相比于大肠杆菌来源的重组酶有了提高,热稳定性也有了进一步的提高,这些都更利于谷氨酸氧化酶的工业化应用。通过糖苷酶EndoH与SDS-PAGE凝胶电泳鉴定分析,发现酵母来源的重组酶发生了糖基化,这也能解释其热稳定性提高的原因。对谷氨酸氧化酶的转化反应条件进行了优化,加入了过氧化氢酶,产物α-酮戊二酸的浓度可达106 g/L,转化率约为95.5%。2.L-氨基酸氧化酶基因kc-laao的克隆,表达和表征本研究合成了来源于北里孢菌（Kitasatospora cheerisanensi）的L-氨基酸氧化酶基因kc-laao（GenBank:WP051653666.1）,首先将该蛋白在大肠杆菌中进行了表达和活性表征。IPTG诱导后,重组酶主要以包涵体的方式存在于沉淀中,为此我们将该基因与可溶性标签（c17、mCherry、sfGFP）进行融合表达,SDS-PAGE显示促可溶标签c17、mCherry、sfGFP对kc-LAAO蛋白确实具有较好的促可溶作用。切除可溶性标签后,酶活实验显示该酶的最适反应温度和pH分别是20℃和5.5,在30℃热稳定性较好,超过该温度活性会急剧下降;然后我们又将该酶在毕赤酵母中进行了表达,这里利用pHBM905BDM载体在体外实现了该基因多拷贝数质粒的构建并且电转化毕赤酵母,摇瓶实验结果表明多拷贝菌株的酶活相对于单拷贝有了大幅提高,多拷贝表达菌株P-kc-LAA02、P-kc-LAA03和P-kc-LAA04的的发酵上清中kc-LAAO的酶活水平分别是单拷贝表达菌株P-kc-LAAO1的1.89,2.47和3.06倍;后面采用4拷贝的重组菌株进行了高密度发酵实验,采用DO-stat补料工艺,发酵结束时菌体湿重和酶活性最高分别达到280 g/L和120.8U/mL,相比于摇瓶均有了很大的提高。然后将毕赤酵母表达的重组酶进行了活性表征,酶的最适反应温度和pH分别是2C℃和6,相比于大肠杆菌来源的重组酶有了提高,热稳定性也有了进一步的提高,这些都与L-谷氨酸氧化酶非常相似。同样的,糖苷酶Endo H与SDS-PAGE实验证实了酵母来源的kc-LAAO重组酶发生了糖基化。对氨基酸氧化酶的转化反应条件进行了优化,加入了过氧化氢酶,产物α-酮戊二酸的浓度可达103 g/L,此时的转化效率是85.8%,时空转化率为3.46 g/L/h。3.L-谷氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶的表面展示及其固定化研究本研究利用酿酒酵母细胞壁结合蛋白SED1作为锚定蛋白,中间引入了HA标签便于检测基因的定位与表达,L-氨基酸氧化酶作为展示蛋白。Western印迹和荧光共聚焦照片显示L-氨基酸氧化酶成功的在毕赤酵母细胞表面进行了展示,流式细胞仪分析显示L-氨基酸氧化酶示在细胞表面的展示率为77.95%。研究了大肠杆菌和毕赤酵母细胞固定化的方法和条件,通过对含有酶的固定化细胞与含有酶的全细胞进行底物催化反应比较,发现固定化细胞比全细胞直接反应表现出相货对较好的温度耐受性和pH耐受性。通过对固定化细胞的使用频次研究发现,固定化细胞比全细胞反应使用频次更多。固定化细胞对底物的成功催化为L-谷氨酸氧化酶的工业化应用奠定了基础。4.固定化细胞技术测定酱油中L-谷氨酸钠含量的应用本研究将大肠杆菌表达的L-谷氨酸氧化酶以及L-氨基酸氧化酶固定到特定形状的膜上,配合过氧化氢电极,测定各种品牌酱油中谷氨酸钠的含量。结果表明,该酶膜测试稳定性良好,精密度高,整个测试过程耗时不超过1 min,是一种高效,高精确度,方便快捷的定量分析方法。制备的酶膜放置4℃,可以重复使用3个月,都能保持良好的检测性能和准确性。