论文部分内容阅读
Ca是植物生长发育必需矿质营养元素。作为第二信使,它是感应细胞内外环境最重要的信号分子,在细胞内承担着重要作用。NIK1(NSP-interacting kinase)是一种受体蛋白激酶,是双生病毒核穿梭蛋白(NSP)的毒力靶标。NIK1属于富含亮氨酸重复序列受体类蛋白激酶(LRR-RLKs)家族,是受体类激酶(RLKs)中最大的亚家族,该类激酶在植物生长发育、环境胁迫应答等方面发挥着重要作用。目前,NIK1在防御信号的传递和抗病毒感染方面的作用已有较为深入的研究,然而关于NIK1在植物Ca依赖性生长方面的功能还尚未明确。本研究以nik1突变体为研究材料,对NIK1基因及相关蛋白的功能进行研究,初步揭示了NIK1抑制低钙诱导拟南芥H2O2产生的机制。本论文的主要研究结果如下:(1)通过不同Ca2+浓度表型分析,发现在低Ca2+(0μM Ca2+)条件下nik1突变体植株矮小且叶片卷曲发黄,生长状态明显弱于野生型Col-0。同时,发现nik1突变体的根长短于野生型植株,鲜重也低于野生型植株。突变体回补试验结果表明低钙敏感表型可以被恢复,由此证明NIK1基因的缺失造成了nik1突变体的低钙敏感表型。(2)为了进一步研究NIK1基因是否影响植物对钙的积累,利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定植株Ca含量。发现在CK及低钙条件下,与野生型Col-0相比,nik1突变体叶片和根中的Ca含量均无显著差异。由此推断NIK1基因不参与植物体内Ca元素的积累。(3)构建由NIK1启动子驱动GUS报告基因的植物材料,获得稳定遗传的T3代植株,通过GUS组织化学染色法,发现NIK1基因启动子可启动GUS基因在拟南芥不同组织,不同生长时期均有表达。(4)通过转录组学分析,筛选出46种突变体比对野生型植物的基因表达量变化差值>5的相关基因,并发现多数基因与过氧化氢及水杨酸产生相关;通过半定量PCR实验,检测出其中6种基因(At1g21250、At2g24850、At2g18660、At5g61160、At1g02450、At4g23150)表达均上调,由此验证了转录组数据的可靠性。随后,进行DAB(Diaminobenzine)组织化学染色,结果表明低钙条件下,nik1突变体内H2O2的积累量要显著高于野生型Col-0。荧光染料DHR(Dihydrorhodamine-123)处理结果表明低钙条件下nik1突变体根中H2O2的积累量要显著高于野生型Col-0。(5)体外表达纯化获得含有GST-NIK1 Kinase Domain多肽,使用微量热等温滴定量热仪(MicroCal iTC200)测定GST-NIK1 Kinase Domain与离子的结合特性,结果表明GST-NIK1 Kinase Domain可与Ca2+、Mg2+、Mn2+特异性结合。