第一部分小细胞肺癌的蛋白质组学研究目的:小细胞肺癌（SCLC）是一种高度侵袭性的肺神经内分泌肿瘤,具有增殖快、转移早、易耐药等特点。SCLC的分型经历了从基于形态学的经典型/变异型发展到基于神经内分泌指标表达的神经内分泌/非神经内分泌型,再到基于转录组学的转录因子定义亚型的漫长过程。但目前的分型体系并不能解释所有的小细胞肺癌发生发展过程中出现的现象,对预测患者预后、指导临床治疗的作用十分有限。本研究旨在阐明小细胞肺癌的蛋白质组学特征,并建立一种指导小细胞肺癌治疗的蛋白质组分型方法。方法:本研究纳入2012-2018年间共75例手术切除后福尔马林固定石蜡包埋的小细胞肺癌标本。通过蛋白质提取、质谱检测、蛋白质鉴定和定量完成SCLC蛋白质组检测,分析SCLC特征蛋白表达谱。基于SCLC蛋白表达谱以非负矩阵分解法聚类分析进行分子分型,结合临床信息,分析各亚型的化疗响应和预后,分析不同亚型的分子特征,挖掘治疗靶标。结果:本研究数据集共鉴定出11158个蛋白质。经过质量控制和数据过滤,得到445个非负矩阵因子分解（NMF）一致聚类的蛋白质,NMF聚类结果显示与SCLC患者预后相关可分为三个亚组,分别是S-I（n=28,37%）、S-II（n=20,27%）和S-III（n=27,36%）。S-I、S-II和S-III亚型与总生存预后呈逐渐恶化的分层关系,生存曲线可见显著性差异。小细胞肺癌蛋白质组分型独立于转录组学分型存在。高增殖活性是三种SCLC分型共有的特征。S-I型SCLC具有较强的DNA修复能力,预后良好,对化疗反应最佳;S-II亚型是免疫亚型,具有丰富的细胞外基质和显著的免疫应答,巨噬细胞浸润在S-II型最为显著。S-II型和S-I型自然病程类似,但S-II型化疗后反而预后更差;S-III型恶性生物学行为显著,预后最差,对化疗响应不足。基于这三种亚型中的共同信号通路和高表达蛋白,可能的治疗靶点包括CDK1、CDK2、E2F1和SP1等;对于S-I亚型,DHPS和UBA5可能是潜在的靶点。对于S-II亚型,我们确定了11个候选靶标,包括DPEP1、VWF、MAOB、CASP1、TBXAS1、CEACAM6、C1R、ICAM1、DPYD、S100A10和NNMT。在S-III亚型潜在的靶点中,针对PRKAG1和BCL2已有FDA批准的药物可用,其他靶点包括PI4KB、TRAF2、ATOX1、ATAD2、AKAP8、GSK3A、RAC1、STK38、ERMP1。结论:本研究通过蛋白组学界定了SCLC的三个亚型,对小细胞肺癌的治疗已有指导意义:S-I亚型,预后好,对化疗敏感,最适合现在的临床治疗指南;S-II亚型,是免疫亚型,可能是免疫治疗的收益者;S-III亚型,预后差,化疗不敏感,免疫微环境不显著,急需发现新的治疗靶点。基于蛋白质组学的分层模式可以对小细胞肺癌的化疗敏感性和临床预后进行预测,具有明确的临床应用价值。第二部分法舒地尔促进小细胞肺癌分化成熟与凋亡目的:小细胞肺癌（SCLC）增殖迅速,易发生早期转移和获得性化疗耐药。在过往四十余年里对SCLC疗法的探索中,有超过40个大型三期临床研究未达到预期目标,超过60项药物探索失败。因此,我们仍然需要继续探索新的药物,给患者带来更长的生存和更多的选择。ROCK1/2信号通路的激活可抑制神经纤维形成和神经损伤后的修复再生过程。我们推测,法舒地尔可能成为一种用于小细胞肺癌诱导分化治疗的潜在药物。方法:通过免疫组化检测113例小细胞肺癌、17例肺典型类癌、23例肺不典型癌以及35例肺大细胞神经内分泌肿瘤标本中ROCK1/2表达情况。细胞水平上,以CCK8实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验探究法舒地尔刺激后的小细胞肺癌细胞增殖活性、细胞周期、细胞凋亡水平的变化,同时观察细胞形态学变化。利用转录组测序探究法舒地尔对小细胞肺癌细胞转录调控的影响,通过生物信息学分析探究SCLC细胞分化和发育相关基因表达变化,以q RT-PCR和Western blot验证细胞周期蛋白和分化发育相关基因在基因和蛋白水平的变化。在裸鼠异种移植模型中评估法舒地尔的药效。结果:ROCK1在所有TC、AC和LCNEC样本中均为阴性,在SCLC中阳性率为77/113,68.1%。ROCK2在所有AC和LCNEC样本中均为阴性,但在14/17,82.4%例TC和94/113,83.2%例SCLC样本中为阳性。ROCK1/2在SCLC阳性率远高于其他三种肺神经内分泌肿瘤。细胞水平上,法舒地尔诱导小细胞肺癌产生突触样形态变化并抑制其细胞活性,IC50为76.04μg/m L。细胞周期分析显示,与对照组相比100μg/m L法舒地尔刺激24和48h后,S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞数量略有增加,G2/M期细胞数量明显增加。浓度梯度法舒地尔刺激72h后,流式检测凋亡水平发现早期凋亡细胞呈浓度依赖性地增加。转录组测序分析中,一方面通过时序分析发现涉及细胞周期的调控、DNA复制和染色体分离等肿瘤增殖相关基因表达下调,另一方面发现大量差异基因参与了正向调控神经元分化、干细胞分化、细胞发育和神经系统发育。接下来选取了神经相关差异基因和细胞周期相关差异基因进行q RT-PCR验证。同时蛋白水平上验证了法舒地尔刺激后,SCLC细胞中ASCL1、CDK4和CDK6的表达水平降低,而SOX11、PLK5和SLIT2的表达水平升高。CDK6、SOX11、PLK5和SLIT2等蛋白表达模式与RNA-seq和q RT-PCR中DEGs的趋势变化一致。裸鼠成瘤实验中法舒地尔表现出抑制肿瘤生长的作用。在形态学上,法舒地尔组肿瘤组织间质丰富,细胞排列疏松。Gordon-Sweet网状纤维染色显示法舒地尔治疗组有更多的纤维网状间隔,提示法舒地尔在体内可促进小细胞肺癌的结构成熟,即组织成熟性增加。TUNEL实验进一步证实法舒地尔在体内可诱导细胞凋亡。结论:本研究表明ROCK1/2在SCLC中高表达,ROCK1/2可能是SCLC的潜在治疗靶点。法舒地尔可能在SCLC诱导分化治疗中具有新的应用。