学习记忆力减退属中医“健忘”、“善忘”的范畴,是脑功能失常的重要体现,伴随生活压力的增大,学习记忆力下降也成为影响人们生活质量的重要因素之一。记忆下降由多种因素导致,在中青年人群中多因不良生活习惯引发,如缺乏运动、熬夜、嗜酒等,其中被广泛关注的是睡眠障碍引起的记忆力下降,这种睡眠障碍可通过剥夺睡眠模拟。现本课题以睡眠剥夺法复制学习记忆障碍模型,观察四逆散加味对模型动物学习记忆能力影响的神经生物学机制。第一部分理论研究对历代医家在睡眠与学习记忆方面的认识进行理论探讨,睡眠及学习记忆的形成和巩固与肝、心、肾的联系较大。在学习、记忆过程中,肝、心、肾、脑通过气血、经络、五藏神功能相互贯通,对信息处理各有分工。人对外界事物的接触首先从心的“任物”开始,对所感进行思考、分析,形成初步印象,经过回忆、存忆的过程进行再判断,并对信息进行整理,最后稳固记忆并存之于脑,整个过程贯穿肝的疏泄作用以及肝魂的调节。对于睡眠不足引起的学习障碍,理论上讲,肝失疏泄、心神失养和肾精不足可作为主要辨证类型,而不单单限于对心、肾的调节。第二部分实验研究研究一睡眠剥夺大鼠的一般情况及学习记忆能力评价目的：复制学习记忆障碍模型,通过行为学评价模型,并观察四逆散加味对学习记忆力的影响。方法：采用大鼠睡眠剥夺法复制学习记忆障碍模型,并观察各组大鼠的一般情况、体重、Y型迷宫成绩、血清SOD的变化。结果：①一般体征变化：从造模第3天开始到造模结束,对照组大鼠一般情况良好,模型组和用药组出现不同程度的躁狂、攻击性、警惕性高、撕咬、脱毛、便稀等体征,四逆散和复合方治疗组的体征较模型组和生慧汤治疗组减轻。②体重变化：造模开始到结束,观察第0、3、5、8天大鼠体重变化,对照组大鼠体重增加,模型组和三个用药组体重呈现不同程度减轻,与对照组比较,其余四组在4个时间点的体重都有非常显著差异,但四个组之间体重无差异。③Y型迷宫成绩：测试各组大鼠第0、7天的错误反应次数和主动回避率,第0天各组间无差异,造模第7天,错误反应次数结果显示,与对照组比较,模型组和三个用药组错误反应次数明显增多,模型组、四逆散治疗组、生慧汤治疗组有非常显著差异,复合方治疗组有显著差异；与模型组比较,复合方治疗组错误反应次数明显减少,有非常显著差异,而四逆散和生慧汤组无明显差异。主动回避率结果显示,与对照组比较,模型组、四逆散治疗组、生慧汤治疗组主动回避率降低,具有显著差异,而复合方治疗组无明显差异；与模型组比较,复合方治疗组主动回避率增加,有非常显著差异,四逆散治疗组增加,有显著差异。④血清SOD表达：与对照组比较,模型组和生慧汤治疗组SOD含量降低,有非常显著差异,四逆散和复合方治疗组SOD含量无显著差异；与模型组比较,四逆散和复合方治疗组SOD含量显著升高,两个治疗组之间比较,四逆散组显著低于复合方组。结论：①睡眠剥夺能导致大鼠记忆力下降,并伴随一般体征、体重的改变。②疏肝补肾养心方能改善睡眠剥夺所致的记忆障碍,疏肝方能部分改善记忆能力,单纯补肾养心无明显调节作用。研究二睡眠剥夺大鼠行为学的改变及四逆散加味的调控作用目的：观察四逆散加味对睡眠剥夺大鼠对新奇环境认知的影响。方法：应用自制旷场箱进行旷场实验。结果：造模第0天,各组旷场指标无显著差异。造模第7天,在直立次数(垂直得分)方面,与对照组比较,模型组明显减少,有非常显著差异；与模型组比较,三个治疗组次数增多,有显著差异。在穿格次数(水平得分)方面,与对照组比较,模型组明显减少；与模型组比较,四逆散治疗组增多,有显著差异,生慧汤治疗组明显增多,差异非常显著。造模第7天,中央区停留时间方面,与对照组比较,模型组时间增加,有非常显著差异；与模型组比较,生慧汤、复合方治疗组时间缩短,有显著差异,四逆散治疗组时间明显缩短,差异非常显著。在修饰次数上,与模型组相比,复合方治疗组明显增多,其余组间无显著差异。结论：①睡眠剥夺能降低大鼠的空间探索能力、兴奋性和认知能力,对适应能力无明显影响。②疏肝方、补肾养心方及复合方均可能改善睡眠剥夺所致的情绪、认知障碍,三个组方从不同角度进行调节。研究三睡眠剥夺对大鼠海马BDNF及高亲和力受体TrkB的基因和免疫阳性物表达的影响及四逆散加味的调节作用目的：观察四逆散加味对睡眠剥夺大鼠海马中学习记忆相关重要蛋白BDNF和TrkB表达的影响。方法：采用免疫组织化学和荧光定量PCR法,测定海马CA3区和DG区BDNF和TrkB蛋白免疫阳性物表达和海马中基因的表达。结果：①在海马CA3区和DG区均可见BDNF免疫阳性物的分布,其阳性产物为棕黄色颗粒状,呈椭圆形或锥形,主要分布在CA3区锥体细胞的胞浆、胞核(以核膜最密集)和DG区颗粒细胞的胞浆、胞核。TrkB免疫阳性物为细小的棕黄色颗粒,呈圆形或锥形,分布在CA3区锥体细胞的胞浆,胞核无分布。②BDNF蛋白表达：CA3区结果显示,与对照组比较,模型组和三个治疗组BDNF平均光密度值减小,差异非常显著；与模型组比较,复合方治疗组平均光密度值增大,差异非常显著,四逆散和生慧汤治疗组无显著差异。DG区结果显示,与对照组比较,模型组与三个治疗组的BDNF平均光密度值减小,差异非常显著；与模型组比较,四逆散、生慧汤和复合方治疗组的平均光密度值无显著差异。③BDNF基因表达：与对照组比较,模型组海马BDNF mRNA表达减少,差异非常显著；与模型组比较,四逆散和生慧汤治疗组BDNF mRNA表达无显著差异,复合方治疗组海马BDNF mRNA表达明显增多,差异非常显著。④TrkB蛋白表达：CA3区结果显示,与对照组比较,模型组和三个治疗组TrkB蛋白平均光密度值减小,差异非常显著；与模型组比较,四逆散和复合方治疗组的蛋白平均光密度值增加,差异非常显著,且四逆散组表达比复合方少。DG区结果显示,与对照组比较,模型组和三个用药组的TrkB阳性物平均光密度值减少,有非常显著差异；与模型组比较,三个用药组平均光密度值无显著差异。⑤TrkB基因表达：与对照组比较,模型组TrkB mRNA的表达减少,差异显著,四逆散、生慧汤、复合方治疗组无显著差异；与模型组比较,四逆散治疗组和复合方治疗组的TrkB mRNA表达量明显增多,差异显著,生慧汤治疗组的TrkB mRNA表达无明显增加。结论：①睡眠剥夺能降低海马BDNF和TrkB蛋白及基因的表达。②疏肝补肾养心方能上调海马BDNF和TrkB的基因表达和CA3区蛋白的表达。③疏肝方的作用点相对狭窄,对TrkB的表达有上调作用。研究四睡眠剥夺大鼠海马区非受体酪氨酸激酶Fyn基因表达及四逆散加味的干预作用目的：观察四逆散加味对睡眠剥夺大鼠海马Fyn基因表达的影响,总结Fyn与BDNF、TrkB在改善学习记忆方面的关联。方法：通过荧光定量PCR法,测定海马Fyn基因表达。结果：与对照组比较,模型组海马Fyn mRNA的表达量明显减少,具非常显著差异；与模型组比较,生慧汤、复合方治疗组大鼠海马Fyn mRNA的表达增多,以复合方治疗组增多明显,而四逆散治疗组无显著差异。结论：①睡眠剥夺能降低海马Fyn基因的表达。②补肾养心方和复合方能通过调节Fyn基因的表达改善睡眠剥夺形成的学习记忆力下降,复合方更明显。③睡眠剥夺大鼠海马Fyn与BDNF及其受体基因的表达具有一致性,三种蛋白对学习记忆的调节作用可能通过同一信号通路。研究五睡眠剥夺大鼠海马区ERK及pERK蛋白表达及四逆散加味的调节作用目的：观察四逆散加味对睡眠剥夺大鼠海马ERK及pERK蛋白表达的影响,并总结与非受体酪氨酸激酶及脑源性神经营养因子的联系。方法：通过免疫印迹法,观察ERK及其活化形式的蛋白表达。结果：①ERK2蛋白表达：与对照组比较,生慧汤与复合方治疗组表达增多,差异显著；模型组和四逆散治疗组未见明显变化。与模型组比较,生慧汤和复合方治疗组表达明显增多,差异显著。②pERK2蛋白表达：与对照组比较,模型组表达明显减少,复合方治疗组表达显著增多；与模型组比较,复合方和生慧汤治疗组都上调蛋白表达,以复合方的作用更明显。结论：①睡眠剥夺能明显减少记忆形成相关和pERK2的蛋白表达量,但对ERK2无显著作用。②复合方与补肾养心方能改善睡眠剥夺大鼠海马pERK的下降,上调ERK2及pERK2的表达,以pERK2的表达上调更明显。③ERK及其活化形式可能与BDNF、Fyn共同参与睡眠剥夺所致的学习记忆力下降。小结本研究首先据睡眠理论、五藏神理论,着重从肝、心、肾角度探讨睡眠的形成及学习记忆的发生机制,人对新事物的接触首先从心的“任物”开始(神),对所感进行思考、分析,形成初步印象(志),经过回忆、存忆的过程进行再判断,并对信息进行整理,稳固记忆并存之于脑。记忆的形成和巩固都与肝的疏泄以及肝魂调节作用有关,五藏神尤其是肝、心、肾对睡眠及引起的学习记忆障碍至关重要。分析实验研究结果总结为以下4点：①对大鼠进行连续7天睡眠剥夺可导致学习记忆障碍。②四逆散和生慧汤的复合方能通过调节海马内ERK-pERK/BDNF/TrkB/Fyn信号转导途径改善睡眠剥夺所致学习记忆障碍。③四逆散、生慧汤作用点较狭窄,从行为学、部分蛋白、基因几方面来调节记忆力。④疏肝法、补肾养心法的协同作用对记忆力调节作用较全面、稳定。