研究进展显示，不仅在人类正常组织内包括神经组织存在干细胞，在人类的肿瘤组织内也存在干细胞，这些为人类不可再生性疾病的细胞替代治疗及肿瘤发生发展机制的阐释带来了新的机遇与挑战。本文选择人胚胎神经视网膜和RB肿瘤为研究对象，试图揭示人胚胎神经视网膜的分化发育规律及其视网膜干细胞(retinalstemcell，RSC)的特性；探讨RB肿瘤中是否存在肿瘤干细胞(retinoblastomatumorstemcell，RTSC)及其相关特性；初步比较RTSC与RSC的异同。上述研究将为人类视网膜组织工程或再生医学研究奠定基础；为RB的发生、转移和复发机制阐释提供新的理论依据；为RB的治疗策略选择提供新靶点，具有重要的理论意义和社会经济效益。 方法 1.实验材料的收集RB肿瘤组织取自2005年3月～2006年1月期间在中山眼科中心四区接受手术治疗的RB患儿，病理诊断由本中心病理科依据WHO肿瘤分类作出。不同胚龄人视网膜组织(包括8-12周龄，19周，23周，25周及28周龄，妊娠龄)取自人工合法流产胎儿，健康成人视网膜组织取自本中心角膜移植术后剩余的眼组织。实验标本的采集依据中山大学及本中心伦理委员会规则实施，并征得患者或其家属知情同意而获得。 2.人胚胎视网膜形态学观察及免疫组化鉴定不同胚龄人眼球，分别用4％PFA固定，冰冻切片，每片6-8um，HE染色，光镜观察；部分胚龄视网膜用2％多聚甲醛及2.5％戊二醛固定，透射电镜观察。不同胚龄视网膜冰冻切片还进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。第一抗-有RSC标签(pax6，nestin，chx10)，7种主要成熟视网膜细胞标签，包括节细胞(GAP43/MAP2)，锥细胞(recoverin)，水平细胞(calbindinD-28)，无长突细胞(syntaxin/pax6)，杆细胞(rhodopsin)，胶质细胞(GFAP)和双极细胞(chx10)。以正常成人视网膜(NAR)为对照，以PBS替代一抗为阴性对照。 3.半定量RT-PCR法进行人胚胎视网膜发育分化基因鉴定TRIZOL法抽提新鲜获取的不同胚龄视网膜组织总RNA，反转录成cDNA，以视网膜发育分化相关基因为引物进行PCR循环扩增。所用引物包括RSC相关基因nestin，pax6，RX，chx1O，CD133，Bmi-1；分化细胞标志基因如ARR3(锥细胞)、CNCG(杆细胞)、GFAP(胶质细胞)及MAP2/GAP43(神经节细胞)。以人β-actin作为内参照，以正常成人视网膜(NAR)为对照。 4.RTSC体外扩增培养新鲜RB组织及细胞系SO-Rb50经酶消化法获取单个瘤细胞，接种于无血清化学限定培养基(SFM)培养，对培养7～15天的神经样肿瘤球体进行传代培养。倒置显微镜下逐日观察。 5.RTSC的干细胞特性鉴定分别对生长在扩增培养条件及分化培养条件的RTSC进行倒置显微镜、电镜观察。用克隆球体形成实验，有限稀释实验，BrdU掺入法的分裂增殖实验及分化实验等鉴定干细胞的自我再续及分裂增殖能力和分化能力，将RTSC移植到NOD/SCID小鼠眼内观察成瘤能力。用免疫细胞化学、RT-PCR或流式细胞仪等方法进行RTSC及其分化细胞的特异分子表达鉴定。 6.RTSC生物学特性检测扩增条件下培养7-14天的RTSC分别进行冻存与复苏能力，细胞周期，细胞增殖活力、染色体核型分析，神经递质(乙酰胆碱、多巴胺及谷氨酸钠)引起RTSC分化前后细胞内钙离子浓度变化等鉴定。 7.RB肿瘤组织的干细胞鉴定用免疫组织化学方法对本中心病理室2005年6月至2005年11月存档的RB肿瘤石蜡标本进行干细胞鉴定。第一抗体为pax6,人特异nestin。 结果 1.人胚胎视网膜形态学及免疫组织化学研究8-9w极早期视网膜未见明显分层，细胞大部分呈神经母细胞/干细胞状态，核大，浆少，电镜下异染色质少，细胞器简单，nestin及pax6阳性细胞弥漫分布，chx1O阳性细胞分布于外神经母细胞层，仅后极部出现节细胞分化，表达GAP43及MAP2。 10-12w早期视网膜已出现ONL，OPL，INL，IPL，GCL等分化层，nestin及pax6阳性的RSC仍弥漫分布在大部分视网膜内，可见少量recoverin阳性的锥细胞分化；水平细胞，无长突细胞，杆细胞，胶质细胞和双极细胞的标签尚无表达。 19w，23w中期视网膜，周边部仍较幼稚，分化层次少，而后极部已与NAR类似，电镜下尚未见到外界膜和外节，nestin及pax6阳性RSC主要位于周边部视网膜和睫状体上皮，后极部视网膜已能表达7种成熟视网膜细胞标签。 25w,28w晚期视网膜，形态学上后极部和周边部都与NAR类似，且7种成熟视网膜细胞均已分化，但电镜检查仍未见到28w视网膜的外节。nestin及pax6阳性RSC的定位与NAR类似，主要位于锯齿缘和睫状体扁平部上皮。 2.人胚胎视网膜发育分化基因的半定量RT-PCR检测RSC相关基因nestin，pax6，RX，chx10等在胚胎视网膜内均有强表达，且神经干细胞标志基因CD133和分裂增殖基因Bmi-1也呈强表达，但8-12w视网膜无锥细胞(ARR3)、杆细胞(CNCG)及胶质细胞(GFAP)基因的表达，仅表达节细胞分化标签MAP2，GAP43；19w及22w视网膜对上述分化基因均有表达。 3.RTSC原代及传代培养RB实体瘤及细胞系SO-Rb50在SFM中可以形成神经球体样肿瘤球体，这种球体可以多次传代，但SO-Rb50源的RTSC生长速度比实体瘤的快，细胞倍增时间约2～5天。电镜下这些细胞核大浆少，细胞器间单，异染色质少，与8-9w人胚胎视网膜细胞或RSC类似。 4.RTSC干细胞特性鉴定 4.1克隆形成能力及分裂增殖能力分析在每毫升1000个细胞的克隆性接种密度下，或有限稀释试验中，RTSC可以连续性地形成克隆；10μmBrdU作用24h后可以掺入到RTSC中，提示具有自我再续及分裂增殖的能力。有限稀释实验也显示，RB实体瘤细胞中干细胞比率约1.1％，SO-Rb50中约1.4％。 4.2视网膜早期发育相关分子的表达鉴定免疫荧光显示RTSC可表达RSC标签蛋白nestin和pax6。流式细胞仪检测显示RB实体瘤细胞中CD133阳性细胞占3.8％，其来源RTSC中CD133阳性细胞占86.3％；RB细胞系SO-Rb50中CD133阳性细胞占10.6％，其来源RTSC中CD133阳性细胞占72.8％，进一步说明SFM可以高效地扩增、富集RTSC。 RT-PCR进一步显示，实体瘤来源RTSC表达神经干细胞或视网膜早期发育的相关基因Nestin，Pax6，RX，Chx10,CD133及Bmi-1。但不同病人来源的RTSC在nestin，pax6，RX及chx1O的表达程度上强弱不一。尤其是来源SO-Rb50的RTSC不表达RX及chx1O，与对照9w人胚胎视网膜及正常成人视网膜的基因表达有差异。 4.3分化能力分化条件下，RTSC可以向神经元和胶质细胞分化，形成视网膜神经网络样结构，该分化细胞部分表达胶质细胞(GFAP)，神经元及神经节细胞(MAP2，GAP43)，双极细胞(PKC-a)，无长突细胞(syntaxin)及锥细胞(recoverin)的蛋白标签，不表达杆细胞(rhodopsin)及水平细胞(calbindin-D28)标签。 4.4成瘤能力RB实体瘤来源RTSC与细胞系来源RTSC接种NOD/SCID小鼠眼内14天后，发现两者在眼内均可成瘤。组织学形态及免疫分子标签(NSE,MAP2及GFAP)表达上，这些移植瘤与人类RB原发肿瘤类似。 5.RTSC生物学特性分析RTSC可以在体外冻存，复苏后仍具有RTSC的特性。细胞周期表现为慢增殖周期。染色体核型分析显示具有肿瘤性的异常染色体改变。神经递质对RTSC分化前后细胞内钙离子浓度变化分析显示，谷氨酸钠可引起RTSC分化后细胞内钙离子浓度升高，对分化前细胞无影响，多巴胺及乙酰胆碱对RTSC分化前后细胞均无影响，说明RTSC分化后的神经样细胞主要为谷氨酸能神经元细胞。 6.RB肿瘤组织的干细胞鉴定RB肿瘤组织内有部分细胞表达pax6和nestin，提示RB肿瘤内存在少量视网膜干细胞样特性的肿瘤干细胞。 结论 1.率先从形态学及分子水平揭示人神经视网膜的胚胎发生遵循由中央到周边，由内到外的时空发育规律。人RSC的分子标签主要为pax6及nestin；RSC从发育早期视网膜的弥漫分布，逐渐向发育晚期的周边部视网膜、睫状体上皮迁移。 2.在国内外首次用SFM培养扩增的方法揭示RB实体瘤及细胞系SO-Rb50中存在少量具有RSC特性样的肿瘤干细胞，此类细胞可能是Rb恶性增殖的根源，也将成为Rb治疗的新靶点。 3.初步揭示RTSC与人类早期胚胎视网膜细胞或RSC有许多类似性，如形态学特点、向大部分成熟视网膜细胞分化的能力，类似的干细胞分子标签等。然而，两者也存在Chx10及RX分子表达等差异。这些提示两者有着千丝万缕的联系。一方面，RSC可能是RB发生的恶性转型细胞；另一方面，RTSC具有RSC的许多特性，间接显示RTSC也可通过分子遗传学操作使其向正常的RSC转变，从而为人类的视网膜视神经变性性疾病的再生医学研究提供新的种子细胞或体外研究模型。