香菇（Lentinula edodes）是一种重要的人工栽培食用菌,具有较高的营养和药用价值。近年来,我国香菇主产区多次爆发因高温胁迫和后续木霉（Trichoderma spp.）感染引起的菌棒腐烂病,香菇热胁迫应激响应的分子机制尚未完全解析。为解析香菇热胁迫应激响应机制,从正向遗传学和反向遗传学两个角度同时出发,可以快速准确地筛选到与热胁迫应激响应相关的目标基因,进而开展基因功能研究。构建香菇T-DNA插入突变体库,可以通过筛选突变体库获取耐热性改变的突变体并定位目标基因。同时,本实验室前期利用蛋白质组学和转录组学等反向遗传学方法,发现香菇色氨酸合酶基因（LetrpB）在热激前后差异表达,推测该蛋白可能与香菇热胁迫应激响应相关。本研究首先构建了香菇T-DNA插入载体和色氨酸合酶基因（LetrpB）的RNAi载体,采用农杆菌介导法,将载体分别转入香菇单核体菌株W1-26和耐热菌株S606菌丝中,在潮霉素培养基上筛选转化子,PCR进一步鉴定阳性转化子。优化了香菇单核体遗传转化体系,初步建成了香菇单核体突变体库,筛选到耐热性、生长速度和菌落形态等表型发生改变的突变体,并对香菇外源T-DNA插入特征进行了分析;对香菇LetrpB基因的RNAi转化子相关表型和色氨酸-IAA代谢通路基因表达量进行了研究,主要结论如下:1.研究发现当共培养时间为60 h、AS浓度为200μmol/L、筛选培养基为MYG、农杆菌OD值为0.8-1.0时转化效率最高,共获得了1000个具有潮霉素抗性的香菇单核突变体。随机检测了其中221个突变体的表型,鉴定到1个菌落形态、10个生长速度和52个耐热性发生改变的突变体。利用全基因组重测序技术检测了48个突变体的T-DNA插入特征,发现突变体单拷贝比例约为52%,插入位点在基因编码区的比例约为56%,且T-DNA区序列存在插入缺失和碎片化插入的情况,其具体分子机制还有待于进一步研究。2.获得了6个香菇LetrpB基因的RNAi阳性转化子,其LetrpB的表达量较耐热野生菌株S606均显著下调,色氨酸-IAA合成通路相关基因Le ALDH和Leami E的表达量也显著下调,但Le Yucc A8的表达量显著上调。表型试验发现,RNAi转化子的生长速度和菌落形态与野生型菌株无明显差异,但转化子的色氨酸含量较野生型菌株显著下调;40℃热胁迫处理24 h后,野生型耐热菌株S606的菌丝体在25℃条件下可以恢复生长,而RNAi转化子的菌丝体则不能恢复生长。研究表明,香菇耐热菌株S606的LetrpB基因参与了香菇热胁迫应激反应。本研究初步建立了香菇单核体突变体库,通过筛选突变体库定位到了一些目标基因,较为系统地分析了外源T-DNA在香菇中的插入整合模式,同时验证了香菇耐热相关色氨酸合酶基因（LetrpB）的功能。本研究为明确色氨酸-IAA代谢途径在香菇热胁迫应激响应中的作用,揭示香菇耐热机制提供了新的线索;为开展香菇基因功能研究奠定了基础,对选育香菇耐热等优良品种也具有积极的实践价值。