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等温核酸扩增在生命科学相关领域有非常广泛的应用,靶序列环化的滚环扩增(Target circle-rolling circle amplification, TC-RCA)技术是本实验室开发的新型恒温扩增技术。本文对TC-RCA技术进行优化改进,为新开发的TC-RCA技术在致病菌检测、免疫检测等领域的应用奠定一定的基础。此外,因接头与模板连接结果对TC-RCA反应特异性有很大影响,本文对Thermus aquaticus(Taq)DNA连接酶的连接特性进行了研究,为TC-RCA技术的应用提供理论基础数据。本文研究内容和结果如下：(1)本研究以双链DNA为模板,设计与之特异性连接的接头,接头与模板特异成环后,加入特异性引物进行RCA扩增,研究了接头错配程度、接头模板浓度比、引物长度及限制性内切酶对TC-RCA反应特异性和灵敏度的影响。结果显示,只有错配接头与模板无法成环时,才不会有非特异性产物生成；接头、模板浓度比是100：1,引物长度在12～15bp和限制性内切酶Hgal能满足对反应灵敏度和特异性的要求。(2) Taq DNA连接酶的连接特性研究内容和结果如下：①以含有稳定发卡结构的DNA链(带有11 nt长的单链部分)和另一条较短的单链DNA(5-10 nt)为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)的添加等因素对连接的影响。结果显示,单链DNA的3’端同发卡结构Ⅰ底物相连时,比单链DNA的5’端同发卡结构Ⅱ底物相连时的连接率更高；可以连接的最短单链DNA片段的长度为6 nt；在20～65℃范围内,连接率随温度升高而升高；在连接时,由两条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率的影响不大；研究还发现,PEG 6000对短的片段(6～7 nt)的连接有促进作用,而对长的片段(8～10 nt)连接的促进作用较弱,甚至有一定的抑制作用。②设计了更加稳定的发卡结构与相对较长的单链DNA(15～20 nt)为连接底物进行连接。结果显示,Taq DNA连接酶在高温(80℃)下活性仍然很高。③设计了的3’-OH末端含有两碱基错配的稳定发卡结构(与限制性内切酶TspRI相同的黏性末端)作为连接底物,研究了Taq DNA连接酶对不同错配的区分能力。结果显示Taq DNA连接酶对3’-OH末端的区分能力最强。④设计不同长度和不同突出端黏性末端的连接,以研究不同黏性末端的连接情况。结果显示,Taq DNA连接酶连接3’端突出黏性末端的能力高于连接5’端突出黏性末端的能力。综上所述,通过优化的实验条件,使TC-RCA反应过程中接头和模板在高温下连接,可提高连接效率和错配识别能力。针对反应特异性因两个接头连接而下降的问题,可设计单链与模板连接后成环,然后在高温下进行RCA反应。此外。对于TC-RCA的应用,如对不同致病微生物的检测、临床诊断等还需深入探索。