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福建牡蛎(Crassostreaangulata)旧称僧帽牡蛎,是福建的重要养殖贝类。《2011年农业部渔业局》的数据显示,2010年福建省牡蛎养殖产量达1,456,106吨,占全国的40%,居全国首位,其中主要养殖品种为福建牡蛎。本论文对福建牡蛎生长相关基因和群体选育进行了研究,拟对福建牡蛎生长相关基因做深一步的了解,同时进行了福建牡蛎群体选育,有望为福建牡蛎良种选育提供理论支持。
本研究采用SSH、454/Roche转录组文库方法,建立牡蛎早期发育不同阶段cDNA文库。SSH文库随机调取672个克隆,送交上海生工测序。获得序列653条,测序成功率97.2%,将其数据进行拼接,得到Unigenes(contigs+singlets)553条,重复序列占测序成功序列15.3%。CAP3除去重复和小于100的低质量EST,得到有效EST553条,平均长度600bp,其中54个重叠组是由两条EST拼接而成,9条是3条EST拼接而成,3条是由4条或4条以上EST拼接而成的。非冗余序列占全部有效测序序列的71.51%。
454/Roche转录组文库共得到566917条EST,平均长度319bp。牡蛎发育的8个时期通过添加不同的物理标签用以区分,去除接头和小于60bp的短片段之后,剩余555215条序列,共173Mb,平均长度309bp。对所得数据进行拼接得到了10462条contig,112366条singleton。Contigs平均长度723bp,singleton平均长度275bp,6878条contig长度超过500bp,1907条contig长度超过lkb。所有基因最后可以Mapping到262个Pathway通路上,其中Pathway包含了生长、代谢、发育、信号转导和细胞膜离子泵等。基因波动最大的30条基因中有10条基因完全不能和genebank中的序列配对,说明双壳贝类可能在发育、生长、变态中具有独特的分子机制。
对454转录组中的IGF-like基因应用RNAi、定量PCR、免疫组化等方法进行了功能验证,其中RNAi干扰后的牡蛎生长速率显著比对照变慢,同时,干扰后的牡蛎其IGF在转录和翻译水平均下降。通过T7展示文库,淘选了一批和牡蛎IGF相结合的EST,根据EST序列,通过RACE实验,克隆了和牡蛎IGF相关的基因11条,分别是:细胞凋亡蛋白,DAP(death-associatedprotein);氯离子通路基因,CIC(Chlorideintracelluarchannel);福建牡蛎细胞凋亡基因,Gadda(growtharrestandDNA-damage-inducible,alpha);生长转录因子,RAs(RASdomainsubfamilybZIP);福建牡蛎同源基因,HOX(HOX12proteinisoform3);低密度脂肪受体,LDLtor(Low-densitylipoproteinreceptor);类胰岛素生长因子受体基因,IGFR(Insulin-likegrowthfactorreceptor)。
针对牡蛎生长性状进行了群体选育,2009年6月,本研究进行了漳浦北江养殖群体为亲本的群体选育,选育目标为生长快速性状。2010年9月和2011年11月分别进行了以生长快速为目标的第二代和第三代选育,选育效果显著,在90天日龄时,第三代选育组总湿重比对照组增加27.93%,差异显著(P<0.01)。对选育三代群体进行遗传分析学分析,结果表明尽管选育三代,但选育后代仍具有很高的基因多态性(PIC>0.5),没有发生明显的近交衰退(P>0.05)。
在对IGF及其相关基因和福建牡蛎的性状关联研究中,IGF的基因拷贝数和牡蛎湿重、软体重正相关,随着选育世代的进行,其IGF基因拷贝数增多,变异系数变小,PIC指数下降,IGF拷贝数可以作为一个候选功能分子标记,进而应用到牡蛎选择育种上。