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诸多研究表明,机械应力(mechanical strain)尤其是张应变,在血管生理稳态维持和血管重建病理机制中均起到重要作用。探讨张应变力学刺激调控血管细胞功能的细胞内信号转导网络,研究其中关键蛋白的生物学效应,对心血管生理和疾病病理研究有重要意义。蛋白质转录后的可逆性磷酸化修饰参与了几乎所有生命活动的调节。然而,生物体内通过可逆性磷酸化修饰参与细胞内信号转导的蛋白质通常仅占细胞内蛋白质总量的不足10%,应用传统蛋白质组学技术分离鉴定差异表达的蛋白质过程中,磷酸化蛋白往往由于表达丰度低而得不到有效显示。所以,我们将稳定同位素标记活细胞培养(SILAC)、Ti O2亲和层析结合质谱分析(MS)的磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)技术应用于张应变调控血管平滑肌细胞(VSMCs)的细胞内信号转导网络研究,以期从整体上观察张应变诱导的细胞中全部蛋白质磷酸化修饰的状态及其变化。应用SILAC技术标记体外培养大鼠VSMCs,应用FX-4000张应变加载系统施加不同时长的生理性张应变:幅度10%,频率1.25 Hz,时间分别为0,15 min,30 min,1 h及6 h。TiO2亲和层析结合质谱分析(MS)得到了时间序列的VSMCs内磷酸化蛋白质的表达谱及相应肽段的特异磷酸化位点。之后,运用DAVID数据库、IPA软件等生物信息学方法对上述磷酸化蛋白质组学数据进行功能分析、信号通路分析和模糊c均值聚类分析(fcm),得到了10%-1.25hz周期性张应变加载条件下vsmcs内磷酸化发生显著变化的蛋白所参与的主要细胞功能及可能的张应变细胞内信号转导网络。结果提示,rho相关的卷曲蛋白激酶(rock)及蛋白激酶c(pkcs)家族可能参与了张应变调控的vsmcs功能。为深入探讨上述磷酸化蛋白质组学及生物信息学提示的力学响应分子rock、蛋白激酶家族在张应变调控vsmcs功能中的作用,我们首先应用westernblotting(wb)技术检测了10%-1.25hz生理性张应变加载不同时间(0min,15min,30min,1h,6h,12h和24h)后rock1,蛋白激酶家族成员p-pkcθ、p-pkcα/β、p-pkcζ/λ、p-pkcδ/θ、p-pkd/pkcμser916、p-pkd/pkcμser744/748以及p-akt随时间变化的磷酸化蛋白质表达情况;之后,应用rna干扰技术探究了rock1在其中的调控作用。本部分结果表明:(1)生理性张应变加载24h显著提高vsmcs活性;(2)生理性张应变显著抑制rock1的表达;(3)生理性张应变分别在短时相(15min&30min)、长时相(6h&12h&24h)两次激活p-pkcθ,但是对p-pkcα/β,p-pkcζ/λ,p-pkcδ/θ无显著影响;(4)生理性张应变激活p-akt和p-pkd/pkcμser744/748是一个瞬时、短暂的效应(15min&30min),但对p-pkd/pkcμser916位点的激活则较ser744/748位点持续更久(持续到1h);(5)干扰rock1促进pkcθ、pkd/pkcμser916及pkd/pkcμser744/748的磷酸化,但抑制akt的磷酸化。基于上述磷酸化蛋白质组学及后续实验验证两部分的结果,我们得出结论:生理性张应变能够增强VSMCs活性,从而发挥保护功能;该功能的实现可能是通过复杂的细胞内信号转导网络实现,其中生理性张应变抑制ROCK1表达,从而调控PKCθ及Akt的磷酸化可能起到重要作用。我们的研究为探明机械应力诱导之血管重建的分子学机制提供了新思路,为心血管疾病的研究提供了一定的实验依据和理论基础。