研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是全球范围内引起终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因之一,也是严重的公共健康问题。蛋白尿是DN的首要临床特征,也是判断DN严重程度的指标,同时蛋白尿又是DN进展的独立危险因素之一。肾小球滤过屏障的破坏将导致蛋白尿的形成,肾小球滤过屏障是由最内层的肾小球内皮、中间层肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)以及最外层的足细胞所组成。肾小球足细胞,又称之为肾小球脏层上皮细胞,被认为是肾小球滤过屏障中最重要的组成成份,在维持肾小球滤过屏障完整性及滤过功能中发挥关键性作用。足细胞是一种高度特异性的终末分化细胞,增殖和再生功能有限,因此,足细胞的凋亡和丢失最终会导致DN蛋白尿的形成。而且,越来越多的研究证据表明足细胞凋亡以及从GBM上脱落在蛋白尿和DN的发生发展中发挥关键作用。然而,目前关于足细胞凋亡的细胞内分子机制并不完全清楚。晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPPs)是一种氧化应激过程中行成的含有双酪氨酸的蛋白交联产物,在体内主要是由白蛋白所形成。Witko Sarsat等首次发现在尿毒症患者血浆中AOPPs升高,其中血透患者最高,接着就是腹透患者,再次就是晚期肾功能衰竭非透析患者。随后,在肥胖者、代谢综合征、原发性肾脏病、IgA肾病、合并或不合并微血管病变的糖尿病患者血浆中均发现AOPPs的聚集。而且,随着肾功能的恶化AOPPs水平进一步升高。因此,AOPPs最近被认为是一种新的致肾脏病因子。同时,大量研究报导血浆AOPPs浓度升高与慢性肾脏病(chronic kidney diseases, CKD)包括糖尿病肾病的发病密切相关。AOPPs处理过的5/6肾切除后的大鼠出现尿蛋白增加、血清肌酐进行性增高以及肌酐清除率下降；并且AOPPs也导致残肾出现明显肾纤维化。在链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病大鼠模型中外源性AOPPs可加重糖尿病大鼠的蛋白尿。而且,最近周丽丽等通过体内和体外研究证实了AOPPs与晚期糖基化蛋白产物受体(Receptor of advanced glycation end products, RAGE)结合后通过NADPH氧化酶依赖的02-生成机制诱导了足细胞凋亡。然而,AOPPs诱导足细胞凋亡的机制并没有完全阐明。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)启动的凋亡途径是近年发现的一种新的凋亡途径。内质网(endoplasmic reticulum, ER)发挥着数种重要的细胞功能,如：新生蛋白的合成、折叠、修饰、转运,以及细胞内Ca2+水平的调节。各种病理生理的因素扰乱内质网的功能导致错误折叠或非折叠蛋白在内质网内的聚集以及内质网内Ca2+稳态的改变,最终引起ERS发生。随后,ERS将触发一系列综合应激通路发生,称之为未折叠蛋白反应(unfoldedprotein response, UPR),主要引起三条经典的UPR信号转导通路,是由三个内质网跨膜蛋白：PERK (double-stranded RNAactivated protein kinase-like ER Kinase)、 ATF6 (activating transcription factor-6)、IRE1 (inositol-requiring enzyme-1)所启动的。然而,UPR的激活一方面触发了恢复内质网功能的适应反应,促进细胞生存；另一方面当严重持续的应激时将促进细胞凋亡。因此,ERS既是细胞抵抗损伤因素的生理性适应保护机制,也是致使细胞损伤和凋亡的重要病理机制。GRP78,也称之为BiP,是内质网特异性分子伴侣,也是UPR的关键调节因子；正常情况下,GRP78与PERK、IRE1及ATF6结合,使它们处于非激活状态；一旦ERS发生,GRP78就与这三个内质网跨膜蛋白分离,转而与非折叠蛋白及错误折叠蛋白结合,因此,GRP78经常被当成一种ERS的标志物。与GRP78解离之后,PERK、IRE1通过自身磷酸化激活,而ATF6转移到高尔基体内切割后激活。激活后的PERK、IRE1及ATF6诱导的信号通路聚集到CHOP,第一个被证实参与调节ERS诱导的凋亡的分子。三条UPR通路,特别是PERK,都可通过诱导CHOP触发凋亡。CHOP,也称之为GADD153,在无刺激因素下低水平表达。在ERS时,CHOP表达上调,因此,也被当成是ERS的另外一个标志物。CHOP-/-大鼠在应对ERS时表现出低的凋亡率,同样ERS不能诱导CHOP-/-细胞凋亡。由此可见,CHOP在ERS诱导的凋亡中发挥关键作用。大量研究表明CHOP是通过抑制抗凋亡因子Bcl-2来诱导细胞凋亡的。Caspase-12特异性位于内质网胞膜上,而且caspase-12的激活参与了ERS诱导凋亡的执行阶段。ERS启动后procaspase-12通过切割后激活,激活后的caspase-12可以进一步激活caspase-9,接着催化procaspase-3的切割,促进ERS特异性促凋亡级联反应。ERS已被广泛证实参与了肾脏疾病的肾小球和肾小管损伤。而且,已有研究表明晚期糖基化蛋白产物(advanced glycation end products, AGEs)、高血糖、白蛋白超负荷及饱和脂肪酸等多种因素均可通过激活ERS诱导足细胞的凋亡。然而,是否ERS参与了AOPPs诱导的足细胞凋亡仍然不清楚。本实验室前期研究发现,AOPPs通过激活ERS诱导人肾小管上皮细胞肥大及转分化；也可通过激活ERS诱导足细胞转分化。因此,我们推测ERS可能参与了AOPPs诱导的足细胞凋亡。而且,如上所述,周丽丽及其同事研究证实了NADPH氧化酶依赖的02-生成介导了AOPPs诱导的足细胞凋亡,而且AOPPs通过与RAGE受体结合,而不是与表达在足细胞表面的其他清道夫受体(SRs)如CD36和SRclassA,诱导足细胞凋亡。最近研究表明了ERS与氧化应激之间存在密切联系。ROS与氧化应激不但与ERS相关,而且参与了UPR促凋亡信号通路的整体组成,这也表明ROS的生成与ERS密切相关联。因此,综上所述,我们推测ERS参与AOPPs诱导的足细胞凋亡可能是由AOPPs与RAGE结合后通过NADPH氧化酶依赖的ROS生成所介导的。本实验的目的旨在通过体外培养小鼠足细胞证实我们上述假设,并进一步阐明AOPPs诱导足细胞凋亡的具体机制。研究方法1. AOPPs修饰的小鼠白蛋白(AOPPs-MSA)的制备和鉴定AOPPs-MSA的制备和鉴定参考文献报导所介绍的方法。将MSA溶液与浓度为200mmol/L的次氯酸以1/140的摩尔比例混合,室温反应30分钟(25～30℃)；然后将制备的样品在4℃无菌PBS中透析24h,以去除残留的游离次氯酸。未经修饰的MSA与PBS等体积混合,作为对照。制备的所有AOPPs-MSA经Detoxi-Gel凝胶柱去除所含的内毒素,内毒素水平通过鲎试验法内毒素检测试剂盒检测,所制备的溶液中内毒素水平低于0.025EU/ml。AOPPs含量测定：在碘化钾存在的条件下,以不同浓度氯胺T制备标准曲线,测定酸性条件下340nm处的吸光度值。AOPPs-MSA和未经修饰的MSA中AOPPs的浓度分别为：70.2±3.41nmol/mg、0.23±0.05nmol/mg。在所有制备的样品中均不能检测到AGEs的成份。2.足细胞的培养小鼠足细胞按文献报导所介绍的方法培养。将未分化的足细胞系培养于含10%胎牛血清、链霉素(100μg/ml)、青霉素(100U/ml)、丙酮酸钠(1mmol/L)、碳酸氢钠(0.075%)和HEPES缓冲液(10mmol/L)的RPMI1640培养液中。在上述培养基中加入10u/ml的重组小鼠□-干扰素的条件下,置于33℃、5%CO2培养箱中,使足细胞处于“允许生长”的条件下生长传代。待细胞生长至70%-80%融合时,不加□-干扰素,置于37℃、5%CO2孵育箱内>12天,使足细胞处于“限制生长”的条件下诱导分化,用于实验。本研究使用的是限制生长的10-18代条件性永生小鼠足细胞。在部分实验中足细胞用ERS诱导剂thapsigargin (0.25μM)处理24h。在阻断实验中,在用200μg/mLAOPPs孵育足细胞24h之前分别用ERS抑制剂salubrinal (50μM)、ROS清除剂c-SOD (100U/mL)和NADPH氧化酶抑制剂DPI (10μM)预处理1h。3.实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达水平收集细胞,加入TRIzol试剂,按试剂盒说明进行操作提取总RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒说明书操作将总RNA逆转到cDNA上。实时定量PCR是按照PCR SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书完成。RT-PCR条件如下：950C2分钟,然后95℃30秒与60℃35秒重复循环40次。所用引物的上游和下游序列分别为：β-actin 5’-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3’(forward)、 5’-AGACAGCACTGTGTTGGCAT-3’(reverse), GRP78 5’-CCTATTCCTGCGTCGGTGTG-3’(forward)、 5’-GCATCGAAGACCGTGTTCTC-3’(reverse), CHOP 5’-GGAAACGAAGAGGAAGAATC-3’(forward)、 5’-CTGGGCCATAGAACTCTGAC-3’(reverse), Bcl-2 5’-ATAACCGGGAGATCGTGATG-3’(forward)、 5’-GTTGCTCTCAGGCTGGAAGG-3’(reverse)。所有的数据以β-actin为内参,用2-△△Ct方法分析表达水平。4.蛋白质印迹分析(Western blot analysis)检测蛋白表达水平将细胞置于RIPA缓冲液中裂解,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白,然后转移到PVDF膜上,再把PVDF膜浸泡在含5%脱脂奶粉的TBST中,室温下封闭2h；用兔抗小鼠PERK、IRE1、ATF6、p-PERK、p-IRE1、cleaved ATF6、 CHOP、Bcl-2、caspase-12、cleaved caspase-3和RAGE抗体(1：1000稀释)与PVDF膜在4℃孵育过夜。再用山羊抗兔二抗与上述PVDF膜在室温下孵育1h,用增强化学发光系统(ECL)检测蛋白,用Total Lab2.0定量条带密度,以β-actin为内参。5. siRNA转染非特异性siRNA和RAGE、PERK、IRE1和ATF6的siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司。按照试剂盒说明操作,用Lipofectamine2000将siRNA转染到足细胞。每段基因的靶向序列分别为：RAGE 5’-GGUCAGAGCUGACAGUGAUTT-3’, PERK 5’-GCAGGTCCTTGGTAATCAT-3’, ATF6 5’-GCAAAGCAGCAGTCGATTA-3’, IRE1 5’-CCAATGTATGTCACAGAAA-3’.非特异性siRNA为阴性对照,Western blot检测siRNA转染后的干扰效果。6.TUNEL检测细胞凋亡按DeadEndTMUNEL系统说明检测足细胞凋亡率。将细胞置于4%的多聚甲醛中在40℃温度下固定30分钟,再用0.1% Triton X-100及0.1%柠檬酸钠透化细胞,然后加入TdT酶及荧光素结合核苷酸在370C孵育60分钟。用荧光显微镜检测标记绿色荧光的凋亡细胞。用DAPI共染样本确定细胞核以鉴别假阳性凋亡细胞。7.细胞内活性氧(ROS)生成量检测应用Reactive Oxygen Species Assay Kit试剂盒检测细胞内ROS生成量,处理后的足细胞用PBS冲洗3次后,加入10μM 2’,7’-DCFH-DA置于370℃暗箱中孵育60分钟,然后用无血清RMPI1640溶液冲洗3次。荧光检测器检测488-nm激发波长和525-nm发射波长用以定量ROS生成量。8.统计分析所有数据均代表3次重复实验的结果,以均数±标准差表示。两独立样本比较采用t检验。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,方差齐时两两比较采用LSD,方差不齐时采用Dunnett’s T3; P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析用统计软件SPSS20.0完成。结果1.AOPPs诱导足细胞发生ERS应用RT-PCR和Western blot分别检测了各组足细胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表达水平,我们发现AOPPs呈现时间和剂量依赖性上调了足细胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表达水平；而空白对照组和未修饰MSA组均无明显上调,而且这两组比较也无显著差异,这说明GRP78、CHOP的过度表达与MSA的晚期氧化相关的。2. AOPPs通过激活ERS诱导足细胞的凋亡我们应用TUNEL的方法检测足细胞凋亡率。AOPPs刺激后足细胞的凋亡率较空白对照组和未修饰MSA组显著增加,而且ERS抑制剂salubrinal可部分阻断AOPPs的效应,而ERS激活剂thapsigargin则与AOPPs一样显著增加了足细胞凋亡率。3. NADPH氧化酶介导了AOPPs诱导的ROS生成AOPPs刺激后足细胞内ROS水平显著高于空白对照组及未修饰MSA组,而且NADPH氧化酶抑制剂(DPI)和ROS清除剂(c-SOD)显著抑制了AOPPs诱导的足细胞内ROS的生成。4. NADPH氧化酶依赖的ROS生成介导了AOPPs诱导足细胞发生ERS应用Western blot检测发现NADPH氧化酶抑制剂(DPI)和ROS清除剂(c-SOD)显著抑制了AOPPs诱导的足细胞GRP78和CHOP的蛋白水平表达。5.ERS参与了AOPPs诱导的足细胞ROS生成AOPPs刺激后足细胞内ROS水平显著高于空白对照组及未修饰MSA组,ERS抑制剂salubrinal部分阻断了AOPPs诱导的足细胞内ROS的生成;而ERS激活剂thapsigargin则与AOPPs一样显著增加了足细胞内ROS的生成。6. NADPH氧化酶依赖的ROS生成介导了AOPPs诱导的足细胞凋亡应用TUNEL方法检测了DPI或c-SOD存在的情况下AOPPs诱导的足细胞凋亡率,我们发现AOPPs刺激足细胞时加入DPI或c-SOD后细胞凋亡率均显著低于单用AOPPs刺激足细胞组。7. RAGE特异性siRNA的有效性检测分别用针对RAGE的靶向siRNA或错义序列无功能的scramble siRNA转染足细胞,用Western blot方法检测两组足细胞的RAGE蛋白表达以评估siRNA转染有效性,结果发现RAGE的siRNA组较scramble siRNA组RAGE蛋白水平显著降低,RAGE siRNA降低RAGE蛋白表达>70%。8. RAGE介导了AOPPs诱导足细胞ROS生成和ERS的发生AOPPs刺激前分别用scramble siRNA (siNC组)或RAGE siRNA (siRNA组)转染足细胞,仅用scramble siRNA转染细胞后无AOPPs刺激作为阴性对照；检测各组细胞内ROS水平发现siRNA组显著低于siNC组。应用Western blot检测结果表明RAGE siRNA转染后显著阻断了AOPPs诱导的足细胞GRP78和CHOP的蛋白表达。9. RAGE介导了AOPPs诱导足细胞ROS生成和ERS的发生AOPPs刺激前分别用scramble siRNA (siNC组)或RAGEsiRNA (siRNA组)转染足细胞,再应用TUNEL的方法检测足细胞的凋亡率发现,RAGE siRNA转染组足细胞的凋亡率显著低于scramble siRNA转染组。10. AOPPs激活了足细胞的PERK, ATF6和IRE1三条UPR信号转导通路应用Western blot险测p-PERK,p-IREl和cleaved ATF6的表达水平发现,与未修饰MSA处理组相比较,AOPPs诱导了足细胞PERK, IRE1的磷酸化,并且上调了cleaved ATF6蛋白表达水平。11.PERK,ATF6和IRE1靶向siRNA的有效性检测分别用scramble siRNA或针对PERK, ATF6和IRE1的靶向siRNA转染足细胞。Western blot检测结果显示,与scramble siRNA组相比较,分别用PERK, ATF6和IRE1的靶向siRNA转染足细胞后,均显著下调了这三个ERS感应蛋白的表达。12.PERK、ATF6、IRE1三条UPR信号转导通路均介导了AOPPs诱导的足细胞凋亡AOPPs刺激前分别用scramble siRNA、PERK siRNA、ATF6 siRNA或IRE1siRNA转染足细胞。与scramble siRNA转染的足细胞相比较,分别敲除三个主要的ERS感应蛋白均可以显著降低足细胞的凋亡率。13.ERS参与AOPPs诱导足细胞凋亡与CHOP及caspase-12依赖的促凋亡途径相关,而且Bcl-2调节CHOP介导的凋亡应用Western blot和RT-PCR的方法检测CHOP, Bcl-2, caspase-12和cleaved caspase-3的表达；与无刺激组和未修饰MSA组足细胞相比较,AOPPs刺激组足细胞CHOP, caspase-12, cleaved caspase-3的蛋白表达水平显著增加,而Bcl-2却显著减少；而且CHOP的mRNA表达水平显著上调,Bcl-2却显著下调；ERS抑制剂salubrinal可部分阻断AOPPs的上述效应,相反,ERS激活剂则可产生与AOPPs-样的上述效应。结论我们的研究结果证实了AOPPs可诱导足细胞ERS发生,并且AOPPs通过激活ERS诱导足细胞凋亡。其次,本研究也表明ERS参与AOPPs诱导的足细胞凋亡是由AOPPs与足细胞表面的RAGE结合后通过NADPH氧化酶依赖的ROS生成所介导的。再次,三条经典的UPR信号转导通路:PERK,ATF6和IRE1通路,均介导了ERS诱导的足细胞凋亡。最后,我们的研究证实两ERS相关的凋亡途径：CHOP-和caspase-12依赖途径,均介导了ERS诱导的足细胞凋亡,而且Bcl-2的抑制参与了CHOP凋亡途径。足细胞凋亡在糖尿病肾病的发病机理方面发挥关键性作用,而且AOPPs的聚集在糖尿病肾病患者中普遍存在,因此,我们的研究从ERS角度为糖尿病肾病的治疗提供了新的策略。