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研究背景与目的乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤,发病率位居全球女性恶性肿瘤的第一位。化疗在乳腺癌综合治疗中起着举足轻重的作用。5-FU是乳腺癌的一线化疗药,尽管乳腺癌对5-FU相对敏感,化疗耐药及耐药后肿瘤复发转移仍然是导致肿瘤病人死亡的重要原因。而乳腺癌5-FU耐药机制,目前尚未阐明清楚。上皮间质转变(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞形态向间充质细胞转变,细胞获得迁移运动能力。最近文献报道,EMT与肿瘤转移、耐药和肿瘤干细胞密切相关。研究表明,多种获得性耐药的肿瘤细胞具有EMT和肿瘤干细胞特点；TGFβ等体外诱导细胞发生EMT改变,细胞对化疗药物表现出更强的耐受性。而EMT与乳腺癌5-FU耐药是否相关,目前国内外尚未见报道。本实验室前期以5-FU诱导建立了乳腺癌耐药细胞(MCF7/5-FU),与亲本细胞(MCF7)相比,MCF7/5-FU细胞变得狭长,细胞之间连接松散,呈现间充质细胞样形态。前期基因表达谱芯片结果显示亲本细胞与耐药细胞中诸多EMT调节因子存在明显差异表达。本研究拟此耐药细胞为模型,结合差异基因芯片结果,探讨上皮-间质转化在乳腺癌5-FU耐药中的作用及机制,揭示乳腺癌5-FU耐药与EMT及肿瘤于细胞之间的联系。以期为阐明乳腺癌5-FU耐药发生发展机制启发新的思路,为预测5-FU化疗敏感性提供新的靶分子及逆转5-FU耐药提供新的策略。方法(1)观察MCP7(?)MCF7/5-FU细胞的形态；qRT-PCR、Westernblot检测EMT标志物的表达；Attachment、Detachmet实验及Transwell迁移、侵袭实验评价侵袭转移能力；流式细胞术分析CD44+CD24-/low干细胞亚群的比例,微球体形成能力评价自我更新潜能,流式细胞术检测SP细胞亚群。(2)采用RNA干扰技术沉默MCF7/5-FU中Snail的表达,比较干扰组和干扰对照组细胞形态、EMT标志物、迁移侵袭能力、肿瘤干细胞之间的差异。然后,采用qRT-PCR、Western blot检测Snail下游靶分子MMPs的表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性。MTS、Annexin V/PI检测5-FU化疗敏感性,Western blot检测Snail下游P53及其凋亡相关信号通路。接下来,转染野生型P53至MCF7/5-FU中,检测EMT、对5-FU的耐受是否逆转。(3) qRT-PCR、Western blo、ELISA分析MCF7和MCF7/5-FU中TGFβ2的表达及分泌,以TGFβ2中和抗体处理MCF7/5-FU细胞评价EMT、肿瘤干性及5-FU耐药是否逆转。Western blot检测TGF(32下游Smad和非Smad信号通路ERK,NF-κB在MCF7、MCF7/5-FU、及TGFβ2中和抗体处理及对照处理的MCF7/5-FU细胞中的活化情况。分别以Smad2抑制剂Staurosporine, ERK抑制剂PD98059,NF-κB抑制剂Bay-117082处理MCF7/5-FU细胞,评价EMT是否逆转。干扰Snail后检测TGF(32/Smad信号通路的变化。MTS检测乳腺癌多个细胞系对5-FU的敏感性,评价细胞的EMT特征,验证TGFβ2/Smad/Snail信号通路在各细胞中的表达及活化。(4)评价不同剂量metformin对MCF7、MCF7/5-FU及MDA-MB-231细胞EMT及肿瘤干性的影响。MTS检测metformin对以上三种细胞生长抑制作用。比较metformin联合5-FU与分别单用5-FU和metformin对细胞生长抑制的差异。Western blot检测metformin处理组及处理对照组AMPK、TGFβ2/Snail信号通路。结果(1)与亲本细胞MCF7相比,耐药细胞MCF7/5-FU变得狭长,细胞之间疏散,呈现间质细胞样形态改变；E-Cadherin等上皮标志物表达消失,Vimenti、Fibronectin等间质标志物表达上调；细胞迁移侵袭潜能增加,具有典型的EMT特点。此外,MCF7/5-FU细胞中肿瘤干细胞比例增多。(2)干扰Snail后,MCF7/5-FU细胞EMT得到逆转,肿瘤干细胞亚群比例下降。Snail通过调节MMP-9、P53增强MCF7/5-FU细胞侵袭转移能力及对5-FU耐药。Snail与P53之间呈负反馈调节,过表达P53抑制Snail的表达,从而逆转EMT及其对5-FU的耐受。(3)MCF7/5-FU细胞中TGFβ2上调,TGFβ2中和抗体能够逆转MCF7/5-FU细胞的EMT,降低肿瘤干细胞比例,增加对5-FU的敏感性。MCF7/5-FU细胞中TGFβ2通过活化Smad信号通路上调Snail。另外,在MCF7/5-FU中干扰Snail后TGFβ2/Smad也下调,而MCF7细胞过表达Snail, TGFβ2/Smad信号通路上调,说明Snail反向调节TGFβ2。此外,在多个乳腺癌细胞系中,进一步证实5-FU耐药细胞具有EMT特点,TGFβ2/Smad/Snail在乳腺癌5-FU耐药细胞中上调。(4)metformin逆转5-FU耐药细胞的EMT,抑制CD44+/CD24-/low亚群细胞,增加5-FU耐药细胞对5-FU的敏感性。Metformin可能通过激活AMPK信号通路抑制TGFβ2/Snail发挥作用。结论(1)首次阐明了乳腺癌5-FU获得性耐药细胞具有EMT和肿瘤干细胞的特点。(2)阐明Snail介导MCF7/5-FU获得EMT、肿瘤干性及对5-FU的耐受。(3)证明P53反向调节Snail,P53逆转MCF7/5-FU细胞EMT及对5-FU的耐受。(4)首次揭示了TGFβ2/Snail之间形成正反馈调节环路,与乳腺癌5-FU耐药相关。(5)初步证实Metformin通过抑制TGFβ2/Snail信号环路逆转乳腺癌5-FU耐药细胞EMT,增加乳腺癌细胞对5-FU的化疗敏感性。