论文部分内容阅读
【目的】 1. 观察支气管上皮细胞被烟草烟雾提取物诱导凋亡情况。 2. SIRT6对烟草烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞凋亡影响及分子机制。 【方法】 1. 制备新鲜 CSE，通过体外培养人气道上皮细胞株（16HBE），加入 CSE诱导细胞，通过荧光定量PCR方法及Western Blot方法检测SIRT6及Caspase-3等因子的表达量。 2. 运用SIRT6-shRNA干扰人气道上皮细胞（16HBE）SIRT6的表达，通过荧光定量PCR方法及Western Blot方法，检测SIRT6及Caspase-3因子的表达量，探讨SIRT6缺失情况下，细胞凋亡是否增加。 3. 运用腺病毒感染诱导人类气道上皮细胞（16HBE）SIRT6的表达上调，通过荧光定量PCR方法及Western Blot方法，检测SIRT6及Caspase-3因子的表达量，探讨SIRT6对发生凋亡的气道上皮细胞的保护作用。 【结果】 1. CSE可以诱导细胞产生凋亡蛋白，且随着浓度的升高，凋亡蛋白表达增多，提示可能凋亡出现的可能。 2. CSE处理后，通过CCK8实验可发现16HBE细胞存活率随着CSE干预下降明显，呈时间（P=0.0004）和浓度（P=0.0001）依赖性。根据 CCK8 法绘制细胞生存率曲线。 3. 我们以新鲜100%CSE配制成1%、2.5%、5.0%、7.5%、10%等不同浓度，刺激16HBE细胞24小时，行qPCR检测Caspase-3的mRNA表达量，提示随着浓度的增高，Caspase-3的mRNA表达量逐渐升高（P<0.0001）。图3.3B是以不同浓度的CSE刺激16HBE细胞24小时，行qPCR检测SIRT6的mRNA表达，结果提示随着浓度的增高，SIRT6 的 mRNA 表达逐渐下降（P<0.0001）。不同浓度CSE刺激16HBE后，行Western Blot检测Caspase-3蛋白表达水平，随着CSE浓度的增高，Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高（P=0.0002）。不同浓度CSE刺激16HBE后，行Western Blot检测SIRT6蛋白表达水平，随着CSE浓度的增高，SIRT6蛋白表达水平逐渐下降（P=0.0002）。 4. 予2.5%浓度刺激16HBE细胞，选取0h、6h、12h、24h、48h等时间点，行qPCR检测Caspase-3 的mRNA表达量，随着时间的延长，Caspase-3的mRNA表达量逐渐升高（P=0.001）。取不同时段，2.5%浓度的CSE刺激16HBE，行qPCR 检测 SIRT6 的 mRNA 表达，结果提示随着刺激时间的延长，SIRT6 的mRNA表达逐渐下降（P=0.0001）。不同时间段，2.5%CSE刺激16HBE后，行Western Blot检测Caspase-3蛋白表达水平，随着刺激时间的延长，Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高（P<0.0001）。不同时间段、2.5%CSE刺激16HBE后，行Western Blot检测SIRT6蛋白量，随着刺激时间的延长，SIRT6蛋白表达水平逐渐下降（P=0.0059）。 5. shRNA干扰16HBE细胞后，SIRT6蛋白的mRNA表达较对照组减少，以2.5%CSE刺激16HBE后，mRNA表达进一步下降（P=0.0004）；SIRT6蛋白水平较对照组减少，以 CSE 刺激干扰后的 16HBE，SIRT6 蛋白进一步下降（P=0.0001）。SIRT6-shRNA转染16HBE后，较对照组Caspase-3的mRNA表达量增高，予 2.5%CSE 刺激后，Caspase-3 的 mRNA 表达水平进一步升高（P=0.0004）；以shRNA干扰16HBE后，Caspase-3蛋白表达水平升高（P=0.0004），行2.5%CSE刺激，较对照组相比，Caspase-3蛋白表达增高（P=0.0003）。 6. 腺病毒感染16HBE细胞后，SIRT6蛋白的mRNA表达较对照组增多，以2.5%CSE刺激16HBE后，mRNA表达进一步减少（P=0.0009）；SIRT6蛋白水平较对照组增高，以 CSE 刺激干扰后的 16HBE，SIRT6 蛋白进一步减少（P=0.0003）。单纯CSE刺激组Caspase-3的mRNA表达升高明显，腺病毒感染16HBE后，较对照组Caspase-3的mRNA表达量增高，予2.5%CSE刺激后， Caspase-3的mRNA表达水平稍升高（P=0.0001）；以腺病毒感染16HBE后， Caspase-3蛋白表达水平增高，行2.5%CSE刺激，较对照组相比，Caspase-3蛋白表达稍增高（P<0.001）。 【结论】 1. 支气管上皮细胞受到CSE刺激以后，细胞活性随着浓度的增加而下降，随着时间的推移下降，凋亡执行蛋白Caspase-3蛋白表达水平浓度升高，与CSE浓度升高平衡，可见CSE可诱导16HBE细胞产生凋亡。 2. 予shRNA-SIRT6干扰以及腺病毒vector感染后，结果显示SIRT6蛋白的DNA合成减少，分泌减少，Caspase-3蛋白合成增多。相反，诱导SIRT6蛋白合成分泌后，Caspase-3蛋白合成减少。可见SIRT6蛋白与Caspase-3蛋白有负相关，起到抗凋亡作用，但具体作用通路留待进一步实验验证。