黑曲霉RAF106与EGCG相互作用关系研究

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表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)具有广泛的生物活性和保健功能,如抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等,备受广大研究工作者关注。然而,EGCG在生物体内的生物利用度极低,限制了其生物活性的充分发挥;研究表明微生物转化可提高EGCG的生物利用度和生物活性,但其转化调控及EGCG与介导转化的微生物间相互关系鲜有报道。鉴于此,本论文旨在以本课题组前期分离到的能介导EGCG生物转化的黑曲霉RAF106为研究对象,深入研究黑曲霉RAF106介导EGCG生物转化的调控机制,并研究EGCG对RAF106生长的影响,将为EGCG以及黑曲霉的进一步开发利用提供理论依据。研究的主要内容与结果如下:(1)RAF106诱导酶可介导EGCG生物转化:RAF106能在只含有EGCG的水溶液中生长且能将EGCG转化成表没食子儿茶素(EGC)和没食子酸(GA),发酵120h后,EGCG的转化率为38.28%,EGC和GA的含量分别比初始值提高了538.29%和2785.55%。经过RAF106的转化后,总酚含量不断上升,至发酵120 h,总酚含量比未发酵前增长了28.76%;此外,转化产物的DPPH自由基清除能力与ABTS自由基清除能力与EGCG差异不明显,说明RAF106生物转化EGCG后可以保持其自身的抗氧化性。再者,RAF106介导EGCG生物转化的酶系是诱导型而不是组成型表达,且随着发酵时间的延长,诱导能力逐渐下降,其中单宁酶是EGCG生物转化过程中一个重要的酶系。(2)RAF106介导EGCG生物转化过程受碳氮源影响;在只含有EGCG的水溶液中添加葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸钠、氯化铵、酵母粉或胰蛋白胨后EGCG转化发生明显变化。氮源(硝酸钠、氯化铵、酵母粉或蛋白胨)调控后能促进EGCG的生物转化,其中酵母粉的的转化速率最快,只需要16 h就能将EGCG全部转化,生成EGC和GA,且随着发酵时间的延长,EGC和GA能进一步发生转化;胰蛋白胨作为氮源的情况下EGCG的转化效率低于酵母粉,需要36 h全部转化EGCG,但比硝酸钠和氯化铵的转化速度要快。然而,EGCG生物转化对不同碳源响应不同,其中乳糖促进EGCG生物转化,转化率较对照提高了102.74%,蔗糖无明显变化,但葡萄糖抑制EGCG的生物转化,发酵120 h,EGCG的转化率比对照组要低54.20%;这种变化可能是碳氮源通过影响单宁酶活性而导致的。以发酵24 h为例,酵母粉处理的单宁酶活性是对照组的3.1倍,胰蛋白胨处理是对照组的2.3倍,硝酸钠为1.3倍,氯化铵为1.5倍。而乳糖、葡萄糖、蔗糖在24 h发酵后对水解酶活性影响不大,但在48 h、96 h后乳糖促进酶活分别提高了18.90%和13.61%,蔗糖无明显差异,但葡萄糖则明显抑制了RAF106分泌胞外水解酶,使其分别下降了49.46%和32.67%。(3)EGCG促进黑曲霉生长繁殖:在CZA、改良的碳源CZA(分别用空白、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、淀粉、乳糖、N-乙酰葡糖胺代替蔗糖)、改良的氮源CZA(分别用空白、亚硝酸钠、酵母粉、胰蛋白胨代替硝酸钠)的平板上EGCG能促进菌落生长,其直径比对照组要大3.21%~94.84%,且菌落完整、菌丝浓密、健壮,形成明显的EGCG水溶圈。再者,不同浓度EGCG都能促进菌丝干重的增加,发酵120 h后,0.5%、1%、2.5%、5%的EGCG的菌丝干重分别比对照组(0%EGCG)提高了61.34%、126.77%、257.14%、158.34%;与此同时,EGCG抑制菌丝球的形成,且促进孢子萌发。再者,转录组测序证实EGCG通过影响代谢、遗传信息加工、信号传导、细胞过程及发育系统相关基因转录表达,特别是激活cdc42-ste11-Fus3信号通路促进黑曲霉RAF106的生长及菌丝分化。
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