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高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的慢性、持续性感染是诱发宫颈癌的主要病因,研发抗乳头瘤病毒感染疫苗对于有效抑制宫颈癌和其他癌症的发生意义重大。HPV是无包膜的双链环状DNA病毒,不同类型的HPV基因组之间高度保守。HPV基因组编码6个“早期”蛋白(E1,E2,E4,E5,E6和E7)和两个“晚期”蛋白(L1和L2)。L1和L2是组成HPV颗粒的两种衣壳蛋白,即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。单独表达L1或L1与L2共表达均可自组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒VLP(virus-like particle),这种VLPs结构与天然的病毒颗粒相似,具有与完整病毒相同的抗原空间表位,可感染诱导动物模型或人体产生高滴度的中和抗体,以保护机体免受感染。L1衣壳蛋白在哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母或细菌中均可表达,并可自发组装形成空衣壳病毒样颗粒(VLP)。L1衣壳蛋白的这一特性为预防性HPV疫苗开发提供了研究手段。每年约有50万妇女被确诊为宫颈癌,其中80%来自于发展中国家。在发展中国家发病率最高的十种HPV类型中,HPV16、18、33、58居前四位,发病率分别为54.7%、16.3%、7.1%和5.2%。我国每年新发病例为13.2万,约有3万妇女死于宫颈癌。针对我国妇女HPV感染型别的分析结果表明,HPV16、18、58和33型感染与宫颈癌的发生最为密切相关。目前上市的两种HPV预防性疫苗均属于针对L1蛋白的VLP混合型疫苗,分别是包含HPV16/18/6/11型VLPs的Gardasil和包含HPV16/18型VLPs的Cervarix。二者都是针对欧美地区HPV在宫颈癌中的流行分布特点而设计的,均不包含HPV33和58两个基因型,因此这两种混合型VLP疫苗不能完全满足中国人群预防HPV相关疾病的需要。本研究利用重组杆状病毒表达系统成功地表达了HPV16/18/33/58四种主要衣壳蛋白L1,并通过电镜观察证实四种L1蛋白可以分别自组装成相应的VLPs。我们首先从HPV基因组中成功克隆了16、18、33、58四种HPV血清亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略对L1蛋白基因进行改造,以提高其在重组杆状病毒表达系统中的表达水平。将优化基因片段插入pFastBac Dual载体中获得的重组载体,通过转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid。用重组Bacmid转染昆虫sf9细胞,获得表达HPV16/18/33/58四种亚型L1蛋白的重组杆状病毒。利用空斑法测定病毒滴度后,以MOI=0.1-0.5感染细胞进行病毒富集。随后,用高滴度的病毒液感染sf9昆虫细胞,SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该重组杆状病毒感染昆虫sf9细胞后成功地表达了L1蛋白,且L1蛋白主要分布在细胞中。同时,我们优化了蛋白表达时间和MOI (multiplicity of infection),获得目的蛋白L1的高效表达。经初步纯化,电镜下观察到HPV16/18/33/58血清型L1蛋白可形成直径约55nm的VLPs,与天然HPV颗粒大小形态相似。HPV16/18/33/58血清型L1蛋白在杆状病毒表达系统中的成功表达为中国优势血清型HPV疫苗的研制奠定了基础。