研究背景帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病,又称震颤麻痹。其主要病理表现为中脑黑质区多巴胺(Dopamine, DA)神经元的变性、丢失以及路易小体(Lewy body, LB)的形成。临床主要表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动弛缓等一系列运动障碍症状。目前,全世界帕金森病患者已经超过600万人,我国65岁以上的老年人群患病率为1.7%,并且出现年轻化趋势,它不仅影响个人的生存质量,也给社会带来了沉重的负担。因此寻找治疗PD的理想方法显得愈加迫切。目前对于PD的病机仍然不十分明确,但已经证实与线粒体功能障碍密切相关。DJ-1是一种常见的与PD发病相关的基因,对于其功能还不十分清楚。目前,已经有研究显示,DJ-1在调节和维持线粒体功能上发挥重要作用,DJ-1调控相关的PI3K/Akt通路在PD中的作用也受到关注,但对于其具体的调控机制和途径仍然不明确。对于PD的治疗目前尚无理想方法,传统中医药因其独特的理论和整体的观念,在临床治疗PD中已经取得了一定的疗效,在改善患者临床症状和提高生活质量上,具有一定的优势。因此,进一步探讨其作用机制,寻求更为有效的治疗方法,具有重要意义。我们前期的研究证实中药复方大补阴丸(Da-Bu-Yin-Wan, DBYW)对PD小鼠中线粒体功能具有明确的保护作用。本研究在前期研究基础上,以DJ-1为核心,探讨DBYW影响DJ-1调控的PI3K/Akt信号通路,进而保护PD中线粒体功能的作用机制和途径,并进一步揭示DBYW对DJ-1基因调控的干预作用,为中药复方在临床上PD治疗的应用提供科学理论依据。研究目的本研究通过将DJ-1基因过表达质粒转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12,探讨DJ-1对PD线粒体功能的保护作用以及过表达DJ-1对PI3K/Akt通路的影响；进而利用神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)建立PD细胞模型,从DJ-1调控PI3K/Akt信号通路的角度,探讨DBYW对PD线粒体功能保护作用的分子机制。研究方法本研究主要分为六部分：实验一.DJ-1质粒的转化、扩增、提取及转染：用热休克法分别对空白对照质粒和DJ-1基因过表达质粒进行的转化后,扩增提取质粒,并进行鉴定；用脂质体介导法将质粒分别转染SH-SY5Y和PC12细胞。采用RT-PCR和Western blot技术检测DJ-1 mRNA和其蛋白的表达,对DJ-1过表达基因转染效果进行鉴定。实验二.DJ-1过表达对SH-SY5Y和PC12细胞线粒体功能的影响：实验分为3组：①正常对照组：无转染；②空白质粒对照组：转染空白质粒；③DJ-1过表达组：转染DJ-1过表达质粒。Mito Tracker探针标记染色后,激光扫描共聚焦显微镜分别观察两种细胞线粒体的活性和形态；荧光素酶法检测细胞线粒体ATP的含量；比色法检测线粒体复合物I(Complex I)的活性。实验三.DJ-1过表达对PI3K/Akt信号通路的影响：分组同实验二。用Western blot技术检测PI3K/Akt信号通路相关PI3K、Akt、GSK3β蛋白的表达以及Akt两个磷酸化位点Thr308和ser473表达水平。实验四.DBYW对DJ-1过表达的PD细胞模型中细胞活性的影响：采用神经毒素MPP+诱导建立PD细胞模型。用CCK-8法检测进行MPP+对细胞的毒性实验,确定建立PD模型的MPP+合适浓度和作用时间。制备中药DBYW,确定中药给药浓度梯度后,实验分为六组：①正常对照组：无转染；②模型组：MPP+诱导造模；③DJ-1过表达模型组：DJ-1过表达质粒转染+MPP+造模；④DBYW低剂量组：DJ-1过表达质粒转染+MPP+造模+DBYW低剂量；⑤DBYW中剂量组：DJ-1过表达质粒转染+MPP+造模DBYW中剂量；⑥DBYW高剂量组：DJ-1过表达质粒转染+MpP+造模+DBYW高剂量。观察中药DBYW对DJ-1过表达的PD模型中细胞存活率的影响。实验五.DBYW对DJ-1过表达的PD细胞模型中线粒体功能的影响：分组实验四。激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体的活性；荧光素酶法检测线粒体ATP的含量；比色法检测线粒体Complex Ⅰ的活性,从而探讨中药DBYW对DJ-1过表达的PD细胞模型线粒体功能的保护作用。实验六.DBYW对DJ-1过表达的PD细胞模型中PI3K/Akt信号通路的影响：分组实验四。用Western blot技术检测DJ-1和PI3K/Akt信号通路相关相关PI3K、Akt、GSK3β蛋白水平的表达以及Akt两个磷酸化位点Thr308和ser473的表达。研究结果1.DJ-1过表达质粒扩增提取完成后,与正常对照组和空白质粒对照组相比,DJ-1过表达质粒转染组的DJ-1 mRNA和蛋白的表达都明显提高。说明SH-SY5Y和PC12细胞的DJ-1过表达转染成功。2.与正常对照组和空白质粒对照组相比,DJ-1过表达能够不同程度地提高SH-SY5Y和PC12细胞线粒体活性、ATP含量以及线粒体Complex I的活性。3.与正常对照组和空白质粒对照组相比,DJ-1过表达能够显著提高SH-SY5Y和PC12细胞Akt磷酸化位点Thr308的水平,下调GSK3β蛋白的表达;而对PI3K、Akt以及其磷酸化位点Ser473的表达没有明显影响。4.与正常对照组相比,神经毒素MPP+诱导后,SH-SY5Y/PC12细胞损伤明显,并随MPP+浓度的增加和处理时间的延长,细胞存活率呈明显的下降趋势。DJ-1过表达能够提高PD细胞模型的存活率,而DBYW能够进一步提高细胞存活率。5.与正常对照组相比,神经毒素MPP+诱导后,SH-SY5Y/PC12细胞线粒体活性、ATP含量以及Complex I的活性都不同程度下降。而DJ-1过表达能够提高PD细胞模型线粒体活性以及Complex Ⅰ的活性,对于ATP含量的有一定的提高趋势,但无统计学差异。与DJ-1过表达模型组相比,在加入DBYW后,这些MPP+诱导的线粒体功能损伤改善作用增强,并且呈现一定的剂量依赖性。6.与正常对照组相比,神经毒素MPP+诱导后,模型组SH-SY5Y和PC12细胞的DJ-1蛋白表达显著下降；DJ-1过表达模型组的DJ-1表达明显提高；而与DJ-1过表达模型组相比,加入中药复方DBYW后进一步上调了DJ-1蛋白的表达。在PI3K/Akt信号通路中,与正常对照组相比,DJ-1过表达不同程度上调了PD细胞模型中Akt两个磷酸化位点Ser473和Thr308的表达水平；而DBYW上调了DJ-1过表达的PD细胞模型中Akt这两个磷酸化位点的水平。另外,MPP+诱导后各组之间PI3K、GSK3β的表达没有明显改变。结论1.DJ-1的过表达能够提高SH-SY5Y/PC12细胞线粒体和线粒体Complex Ⅰ的活性,以及提高细胞中ATP的含量,提示DJ-1过表达能够在一定程度上增强线粒体的功能。2.DJ-1过表达提高线粒体功能的机制可能与上调PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化位点Thr308水平,下调PI3K/Akt信号通路下游底物GSK3β蛋白表达有关。3.中药DBYW能够增强DJ-1过表达对PD细胞模型线粒体功能的保护作用,并且提高DJ-1过表达的PD细胞模型存活率,其机制可能与DBYW上调DJ-1蛋白表达,进而上调PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化位点Ser473和Thr308的水平有关。