论文部分内容阅读
生物丁醇作为石油替代品,具有能量密度高、挥发性低、腐蚀性弱等物理特性。拜氏梭菌是用于生物法生产丁醇的极具潜力的工业菌株,但是利用拜氏梭菌生产丁醇也存在一些缺陷,如丁醇产量低,发酵副产物丙酮比例较高,木糖利用效率低,以及适用于拜氏梭菌的基因编辑技术有限等。因此,本论文主要针对以上问题进行了探究。参与调控因子Spo0A磷酸化的组氨酸激酶在一些产溶剂梭菌,例如丙酮丁醇梭菌中可以调控溶剂合成和孢子分化,而在拜氏梭菌中还没有相关研究。通过同源比对,筛选出6个与丙酮丁醇梭菌组氨酸激酶同源序列超过30%的候选基因,包括cbei2073,cbei4484,cbei2087,cbei2435,cbei4925和cbei1553。采用CRISPR-Cas9n基因编辑技术对上述基因进行删除。敲除基因cbei2073和cbei4484使丁醇产量发生显著性的变化,丁醇浓度分别从9.8 g/L提高到13.8 g/L和11.5 g/L,分别提高了40.8%和17.3%。而且,两株突变菌的丁醇合成速度更快,丁醇生产强度相对于野生菌株分别提高了40.0%和20.0%,证明这两个组氨酸激酶在拜氏梭菌中对胞内的产物合成代谢起到重要的调控作用。同时这两株组氨酸激酶失活菌株的孢子形成数量与野生菌株相比分别降低了96.9%和77.4%。另外四个组氨酸激酶（包括Cbei2087,Cbei2435,Cbei4925和Cbei1553）失活菌株的丁醇产量与野生菌株相比没有明显变化。对控制丙酮合成的乙酰乙酸脱羧酶编码基因adc进行敲除,发酵几乎不产丙酮,乙醇和丁醇浓度也降低,但是丁醇占总溶剂比例（B/ABE）由野生型的69.8%提高到95.0%,是拜氏梭菌产丁醇比例最高的报道;另外,乙酸和丁酸分别从0.5 g/L和0.6 g/L增加到4.0 g/L和1.9 g/L,有机酸积累严重抑制了突变株的生长,使OD600的最大值从3.0降低到2.2。为了恢复丁醇产量,尝试了进一步敲除调控丁醇合成的组氨酸激酶编码基因cbei2073,添加甲基紫精调节电子流,过表达酸重吸收相关基因cbei0305和ald/ctfAB,以及通过dCas9技术抑制基因adc的表达,但均未能提高丁醇产量。在拜氏梭菌中,木糖的转运主要通过木糖质子转运体完成。为提高木糖利用率,通过带有硫解酶强启动子的pIMP1thl质粒过表达了编码基因xylT,以木糖为碳源进行发酵。与野生型相比,xylT过表达菌株的生长情况没有明显变化,利用木糖能力得到了显著提高,木糖消耗量从19.3 g/L提高到23.6 g/L,提高了22.3%。同时,丙酮、丁醇和乙醇的产量均有不同程度的提高,分别提高了71.2%,14.3%和50.0%,丁酸产量提高了约3倍。可见,xylT基因过表达菌株对木糖的转运能力和代谢木糖转化为代谢产物的能力均得到了强化。本论文表明组氨酸激酶参与拜氏梭菌的丁醇合成代谢和孢子发育过程,并提供了提高代谢产物浓度的有效的基因工程策略。此外,本课题得到的高丁醇浓度生产菌、高比例丁醇合成菌以及强化了木糖转运能力的改造菌,都具有潜在的实现工业化生产丁醇的应用价值。