目的调研天然虫漏沉香基地,通过虫漏沉香的质量及其生境土壤真菌群落多样性分析,探讨虫漏沉香质量与土壤真菌多样性的相关性,为虫漏沉香质量评价与控制及其结香机制研究提供一些参考。方法1虫漏沉香质量分析1.1样品的采集及前处理本论文调研基地位于广东省化州市平定镇彭村,根据采样原则(NY/T112.1-2006),使用简单随机划分法确定20个10*10m的采样样方,在样方内使用砍刀分别从3棵或以上白木香树收集有明显虫漏特征的含树脂的木材,样方内采集的样品作为一个批次,共20批,以原木形式带回实验室,使用钩刀等工具将虫漏沉香原木的白木和含树脂木材分离,含树脂的木材部分即为本研究的实验样品虫漏沉香。1.2性状、理化与薄层色谱鉴别及浸出物检测参照《中国药典》(2015年版一部)“沉香”项下检测方法对各批供试品进行性状描述、理化鉴别、薄层色谱鉴别及醇溶性浸出物测定,初步评价各批供试品质量。1.3沉香四醇含量测定参照《中国药典》(2015年版一部)“沉香”项下[含量测定]方法对各批供试品进行沉香四醇含量测定,外标法计算沉香四醇含量,根据沉香四醇含量评价各批样品的质量。1.4乙醇提取物的HPLC指纹图谱分析参照《中国药典》(2015年版一部)“沉香”项下[特征图谱]测定方法对各批供试品进行乙醇提取物的HPLC特征图谱分析;运用中国药典委员会指定的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对各批次供试品进行相似度评价分析,评价各批次样品质量情况。1.5挥发性成分GC-MS分析采用乙醚超声提取法提取各批次供试品挥发性成分,应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”处理总离子流图,计算图谱相似度。运用Agilent MSD化学工作站与NIST 14标准质谱图库,对20批虫漏沉香供试品色谱峰进行鉴定,采用峰面积归一化法计算相对含量及2区峰面积比值(R值),评价各批次样品质量。2 土壤真菌群落多样性分析在选择好的20个样地中,每个样地大致采取梅花型5点取样法,等层等量地采取5个小点的中层土(5～15cm)样品,等量混合均匀5个小样点的土壤样品,作为1个大样,再立即装入对应编号的离心管中密封,每个大样平行3管作为生物学重复,均置于液氮中保存,送样进行土壤真菌多样性(ITS)测序分析;每个样地采取一个大样。使用Qiime软件计算各个样品的Alpha多样性指数;使用软件Muscle(v3.8.31)进行多序列比;使用软件TreeBeST(v1.9.2)构建OTU之间的系统发育树;结合OTU的丰度信息,使用R语言中的GUniFrac(v1.0)包计算两两样本间的Bray-Curtis距离。3 虫漏沉香质量与土壤真菌多样性相关分析3.1 分析指标Alpha多样性指数中的Sobs指数、ACE指数、Shannon指数;土壤真菌优势菌种(丰度均值排名前10的物种)丰度、土壤真菌非优势菌种丰度和(Other)、未知物种丰度和(Unclassified)及土壤真菌非优势菌种丰度。虫漏沉香醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、挥发性成分中的倍半萜类成分的相对百分含量及色酮类成分的相对百分含量、挥发性成分中的共有成分(G1～G17)及特征成分(T1～T4)的相对百分含量。3.2分析方法使用SPSS 25.0软件对分析材料进行统计学分析,通过散点图矩阵考察自变量与因变量的线性关系;数据满足正态性的使用Pearson相关分析,不满足正态性分布的使用Spearman相关分析。使用R语言psych包,基于物种丰度表和质量指标表格进行优势菌种及质量指标的相关系数计算,并使用热图展示结果。结果1虫漏沉香质量分析1.1样品的采集及前处理根据采集方法采集到符合虫漏沉香特征的样品,前处理后得到每个样地的实验用虫漏沉香样品。1.2性状、显色、薄层色谱及浸出物检测各批样品的性状鉴别均符合《中国药典》(2015版一部)规定。理化显色鉴别结果显示各批次虫漏沉香样品均显浅樱红色,少部分样品呈浅樱红偏紫色。各批次样品的薄层色谱行为基本与对照药材一致,各批次的虫漏沉香样品薄层行为基本一致。各批次批虫漏沉香供试品的醇溶性浸出物含量范围为12.32%～22.46%之间,符合《中国药典》(2015版一部)规定,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。1.3沉香四醇含量分析各批次虫漏沉香的沉香四醇含量均达到《中国药典》(2015版一部)限量要求,虫漏沉香的沉香四醇含量个体差异较大,组间沉香四醇含量差异具有统计学意义(P<0.05)。1.4乙醇提取物的HPLC特征图谱分析20批虫漏沉香供试品均出现了《中国药典》(2015版一部)规定的6个特征峰,各批次虫漏沉香间的HPLC指纹图谱相似度在0.36～1.00之间;与形成的对照图谱相似度介于0.61～0.89之间。1.5挥发性成分分析各批虫漏沉香间的GC-MS总离子流图谱相似度在0.36～0.86之间;与形成的对照图谱相似度则介于0.62～0.88之间从20批虫漏沉香样品中共检测出136个化合物,其中共有成分17个,包括α-檀香醇、β愈创木烯、α-桉叶醇、6,7-二甲氧基-2-苯乙基-色酮等化合物;大部分样品检出了沉香螺旋醇、2-(2-苯基乙基)色酮及6-甲氧基-2-苯乙基色酮等特征性成分。各批次批虫漏沉香R值范围为0.85～4.74,2个批次样品(S11、S13)的R值<1,大部分虫漏沉香样品的倍半萜类化合物相对含量高于总色酮类成分。2 土壤真菌群落多样性分析2.1 土壤真菌物种组成分析2.1.1总体土壤真菌物种组成所有样地OTUs共识别到可注释物种11门38纲91目348属350种,从门水平上看,Ascomycota门(子囊菌门)真菌占所有真菌种数的90%;从属水平上看,Penicillium属(青霉属)真菌占全部菌种的39%,属于优势菌种;常用于诱导白木香结香的Fusarium(镰刀属)菌及Lasiodiplodia(可可毛色二孢属)菌亦有检出,分别占全部菌种的2%及0.03%。2.1.2各样地土壤真菌物种组成各样地均检出Penicillium(青霉属)、Archopilus、Stapylotruichm(大孢圆孢霉属)等真菌物种,但各样地内各种真菌的含量分布差异显著(P<0.05)。各样地丰度排名前十的优势菌种有Penicillium(青霉属)、Arcopilus、Staphylotrichum(大孢圆孢霉属)、Gongronella 属、Talaromyces(篮状菌属)、Trichoderma(木霉属)、Fusarium(镰刀属)、Saitozyma、Plectosphaerella 及 Purpureocillium。2.2各样地土壤真菌多样性分析测序深度指数均大于0.99;Sobs指数显示各样地能检测到的物种数范围为269.33-635.33,各样地的物种丰富度统计学差异显著(P<0.01)。Chao1指数及ACE指数显示各样地的物种丰富度跨度从393.89-785.93,各样地物种丰富度统计学差异显著(P<0.01)。Shannon指数及Simpson指数则显示,包含均匀度后,各样地的物种丰富度有所下降,且差异有所减小(P<0.05);Simpson指数在0.8附近,属于较高值。3虫漏沉香质量与土壤真菌多样性相关分析3.1虫漏沉香质量与土壤真菌Alpha多样性指数及优势菌种丰度的相关分析分析结果显示,在Alpha多样性指数中,与Sobs指数有显著相关的仅有倍半萜类成分百分相对含量,为中等程度的负相关;与Shannon指数有显著相关的质量指标有倍半萜类成分百分相对含量、色酮类成分百分相对含量、倍半萜类成分中的G1、沉香四醇及色酮类成分中的T3,其中值得注意的是,Shannon指数与倍半萜类成分含量和色酮类成分含量有几乎相等的中等相关程度,但相关关系相反(与倍半萜类成分为负相关,与色酮类成分为正相关);G1及T3分别作为倍半萜类成分及色酮类成分之一,也呈现了与Shannon指数相同的相关关系;与ACE指数具有显著相关的质量指标为倍半萜类化合物含量、色酮类成分含量及倍半萜类成分中的G5,其中ACE指数与倍半萜类成分含量和色酮类成分含量同样呈现相反的相关关系(与倍半萜类成分为负相关,与色酮类成分为正相关),但ACE指数与倍半萜类成分含量的相关程度稍高于色酮类成分含量,土壤真菌非优势菌种丰度和(Other)及未知物种丰度和(Unclassified)与Other有显著相关的质量指标与Shannon指数相同,相关关系一致,但相关程度较低。优势菌种中,Penicillium真菌在本研究中与最多的质量指标有显著相关关系,并且与倍半萜类成分相对百分含量有极显著正相关;其次是Gongronella属,在本研究中共与9个质量指标相关,包括醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量以及倍半萜类成分中的G4及色酮类成分的T4等指标;Purpureocillium属真菌与8个质量指标有显著相关性,包括倍半萜类成分中的G2、G3、G8、G12及G15等指标;Trichoderma属真菌与5个质量指标有显著相关,包括醇溶性浸出物含量、色酮类成分含量则及倍半萜类成分中的G11、G16及T1等指标;Saitozyma属真菌共与4个质量指标相关,其中与倍半萜类成分中的G1为极显著负相关;Staphylotrichum属真菌与Plectosphaerella属真菌分别与G17及G14有极显著正相关,与其他质量指标则无显著相关性。Arcopilus属及Talaromyces属真菌与所有的质量指标均无显著相关。10个优势菌种中有5个菌种与4个或以上不同的质量指标有显著相关性,且相关关系及相关程度不尽相同,相关程度最高达到0.743(Purpureocillium属与 G12,正相关),最低为 0.256(Penicillium属与 G12,负相关),均属于中等较弱的相关程度。3.2 土壤真菌非优势菌种丰度与虫漏沉香质量的相关分析非优势菌种中,共88个土壤真菌物种对不同的质量指标有显著或极显著相关,占所有非优势菌种的68.75%;在该88个与质量指标有显著相关的菌种,其中有35个菌种各自仅与1个质量指标有显著或极显著相关,其余菌种则各自与2～10个不等的质量指标有显著或极显著相关,且相关关系及相关程度不尽相同。结论1.虫漏沉香样品质量符合《中国药典》一部(2015版)的要求,但虫漏沉香不同批次的质量差异较大;2.虫漏沉香的生境土壤真菌多样性程度较高,组间差异显著;3.土壤中的Penicillium(青霉属)真菌可能是虫漏沉香倍半萜类成分形成的关键菌种;4.Alpha多样指数与色酮类成分含量呈正相关,提示土壤真菌物种越丰富,可能越有利于虫漏沉香色酮类成分的形成;5.非优势土壤真菌与质量指标具有相关性,但相关关系复杂。