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研究目的:在磁珠分选法得到的未成熟B细胞与成熟B细胞中筛选与B淋巴细胞发育相关的LncRNAs,并初步探究这些LncRNAs对B淋巴细胞发育的影响以及作用机制。研究方法:从获得小鼠脾脏,股骨和胫骨出发,分别采用研磨脾脏和注射器冲洗骨髓腔的方法得到脾脏淋巴细胞和骨髓淋巴细胞。运用普通PCR扩增B细胞特异性标记物B220和CD19,鉴定两种淋巴细胞中B淋巴细胞存在。根据B淋巴细胞膜表面蛋白表达的不同,运用磁珠分选法分别从脾脏淋巴细胞和骨髓淋巴细胞中得到IgM+IgD-未成熟B细胞以及IgM+IgD+成熟B细胞。采用流式以及细胞免疫荧光鉴定两种B淋巴细胞分选正确后,用普通PCR以及RT-qPCR方法检测5种与B细胞淋巴瘤相关的候选LncRNAs,即GAS5、TUG1、MALAT1、Linc-P21和HOTAIR,以及另外9种经测序得到的B淋巴细胞中特异性表达的LncRNAs在两种B淋巴细胞中的相对表达量。筛选得到表达量显著差异的LncRNA后,设计其SiRNA并将其瞬时转染进两种B淋巴细胞,分别采用RT-qPCR扩增两种B细胞特异表面分子以及流式的方法检测SiRNA转染后对B淋巴细胞发育的影响。研究结果:(1)分选得到的两种淋巴细胞中均可以扩增出B淋巴细胞marker B220和CD19,即我们分选淋巴细胞的方法正确。在两种淋巴细胞中加入FITC-IgM和PE-IgD抗体进行流式细胞检测,发现脾脏淋巴细胞中未成熟B细胞比例约为15%,成熟B细胞为35%;骨髓淋巴细胞中未成熟B细胞占30%,而成熟B细胞比例则为12%。(2)磁珠分选得到的未成熟B淋巴细胞和成熟淋巴细胞首先经细胞免疫荧光检测鉴定正确,经流式分析后未成熟B细胞在分选后的纯度由30%变为80%,而成熟B细胞的纯度也由35%变为82%。(3)RT-qPCR方法检测5种候选LncRNAs在未成熟和成熟B细胞中的相对表达量,发现:HOTAIR在两种B淋巴细胞中均不表达;GAS5,TUG1和MALAT1在B淋巴细胞发育成熟过程中分别上调了 14倍,7.5倍以及4倍;Linc-P21的表达下调了7倍左右。另外9种在B淋巴细胞中特异性表达的LncRNAs中,我们也发现了表达量有差异的LncRNA。(4)GAS5与TUG1的表达量上调最显著,所以设计了它们的SiRNA并瞬时转染进两种B淋巴细胞中,发现在成熟B细胞中转染效果更好。运用RT-qPCR方法分别检测两种B细胞特异的表面分子的表达,没有发现显著差异;运用流式方法检测,发现GAS5下调后成熟B淋巴细胞比例减少,而两种SiRNA对未成熟B淋巴细胞均无明显影响。实验结论:(1)脾脏淋巴细胞中成熟B细胞数量占优势,而未成熟B细胞主要存在于骨髓淋巴细胞中。可以采用免疫磁珠分选法分别得到IgM+IgD+成熟B细胞与IgM+IgD-未成熟B细胞,并且分选纯度较高。(2)LncRNA GAS5,TUG1和MALAT1在B淋巴细胞由未成熟状态发育成熟过程中显著上调,而Linc-P21显著下调。(3)两种B淋巴细胞中转染GAS5和TUG1的SiRNA前后,在B细胞特异性表面分子的表达上对B细胞的发育没有明显影响。采用流式方法检测,发现GAS5下调后脾脏中成熟B淋巴细胞比例减少,而两种SiRNA对骨髓未成熟B淋巴细胞的发育均无明显影响。