研究背景种植义齿具有良好的稳定性和较高的长期成功率,然而随着接受种牙治疗患者数量的增加,种植体周围炎发生比率也迅速增长。第六届欧洲牙周研讨会将种植体周围炎定义为种植体周同时发生黏膜和骨组织的炎症,类似于慢性牙周炎。根据Mombelli的研究,随访5-10年后,接受种牙的患者中有20%罹患种植体周围炎。种植牙抵抗菌斑引起的继发性细菌感染的能力明显弱于天然牙,种植体周细菌更易突破生物学屏障进入到植体周围骨质内。预防种植体周围炎的关键是感染控制,除了医师在操作过程中严格无菌操作、教会患者保持口腔卫生外,更加重要的是在炎症发生前或有轻度炎症表现时即以抗菌药物进行预防治疗。这一点在有慢性牙周炎病史的患者中尤为重要,研究显示,牙周炎患者在接受种植治疗后,发生种植体周围炎概率明显高于无慢性牙周炎病史的患者。具核梭杆菌为革兰阴性梭杆菌,专性厌氧,最适生长温度37℃,常见于各类口腔慢性感染,同时是种植体周围炎和慢性牙周炎的重要致病菌之一,它能使甲硝唑分解产生乙酰胺,失去抗菌作用,从而对另一种重要的牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌产生保护作用。金黄色葡萄球菌是革兰阳性需氧球菌,常见于各种口腔术后急性感染,如拔牙术后,牙周手术后等,同样也见于种植体周围急性炎症。而且,金黄色葡萄球菌具有较强的成膜作用,可在钛表面形成生物膜,为其他致病菌提供保护作用,协同致病。临床上其他金属材料相关感染中也经常会检测到金黄色葡萄球菌的存在。另外,研究显示金黄色葡萄球菌可以侵害成骨细胞,影响成骨过程。因此,本实验将具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌作为代表性细菌进行研究,所得实验结果可在一定程度上反映临床的实际情况。目前国内常用于种植体周围炎防治的局部药物有米洛环素软膏(商品名派丽奥)、氯己定漱口水等。其中米洛环素软膏可涂布在红肿的炎症牙龈及感染的种植体周袋内,发挥相对持久的局部抗炎作用;而氯己定漱口液可对口腔内黏膜及牙面上的各种细菌产生冲洗和抑制作用。这些药物作用明确,具备杀菌和抑菌能力,在临床长期广泛应用。但自上世纪八十年代以来,抗生素发生细菌耐药性后,耐药菌种类逐年增加,学者们不得不开发更强效的抗菌药物。如β一内酰胺类抗生素(头孢类药物),已由最早的第一代药物发展到第四代,抑菌性不断增强,抗菌谱不断拓宽,即便如此,临床上对四代头孢的耐受性报道并不少见。回顾抗生素发展历史,医学工作者开发一种新药的平均年限约为十年,而耐药菌的产生不过两年,这使得临床药物开发落后于耐药菌产生,而导致这些情况发生的原因是抗生素的滥用和抗生素本身的限制。在这样的大背景下,随着耐药性细菌逐年增加,也为口腔抗生素用药敲响警钟。基于此,近二十余年来,围绕多肽生物活性物质抗菌肽的研究,得到了广泛开展,希望以此取代部分抗生素的使用。抗菌肽是一类碱性多肽活性物质,天然抗菌肽分子量达数千,一般由12到50个氨基酸残基组成。经过全球学者的大量研究,发现这种多肽具有良好的热稳定性、广谱的抗菌活性及不易引发细菌耐药性的优点,其研发在世界范围内掀起了热潮。目前已有数种药物如Enfuvirtide、PG-1等进入到临床三期实验阶段,已经上市的药物有Daptomycin。与二三十载的研发相反,抗菌肽在临床应用上的进展却并不显著,这些归因于抗菌肽在应用方面存在着一些亟需克服的难题。抗菌肽应用最大的难题是合成工艺复杂,合成费用昂贵以及相当一部分抗菌肽的细胞毒性还未控制在安全范围内。随着序列长度的增加,氨基酸种类的不同,上述问题会更加明显。现有文献报道的SMAP29、LL-37及HBD2、HBD3、CecropinB等均显示具有很强的抑菌作用,但同时这些抗菌肽的肽链长,合成难度大、合成费用高,也表现了不同程度的细胞毒性。有市场调查显示抗菌肽的生产成本只有能够达到小于10美元/克,才有望广泛应用于临床。从远期应用的角度来看,不仅要找到有效的多肽,也要开发出性价比更高的多肽。因此本实验前期研究中选择了一种短肽(人工合成九肽P9-0)作为研究对象进行了一系列的抑菌研究。在证实了抗菌肽P9-0具有对具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌良好的抑菌活性后,又以抗菌肽P9-0为模板,通过改序合成了两种新的抗菌肽PJF11和PLC13,作为探索,以期为抗菌肽将来在种植体周及其他口腔炎症控制中的应用提供一定的理论支持。第一章抗菌肽抑菌活性及溶血性检测目的1.测定抗菌肽PJF11和PLC13对种植体周围炎细菌具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。2.测定抗菌肽PJF11和PLC13对人红细胞的溶血作用。3.比较抗菌肽PJF11和PLC13与氯己定漱口液的抑菌效果。方法1.将菌悬液与不同浓度的抗菌肽PJF11或PLC13混匀,记为实验组,同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照,测定最低抑菌浓度。以最低抑菌浓度及以上浓度对应各孔分别取菌悬液涂布在平板培养基上,测定最低杀菌浓度。2.将不同浓度的抗菌肽PJF11或PLC13溶液加入人红细胞混悬液中使红细胞的终浓度为5%,同时设阳性对照和阴性对照。37℃温箱中孵育1h后,离心取上清液,在540nm处测定各管的吸光度值并计算溶血性。3.取适量菌悬液涂板,然后将含不同药量抗菌肽PJF11或PLC13的纸片以及含有氯己定漱口液的纸片贴于其上。于适宜环境中培养后,观察并拍照。结果1.抗菌肽PJF11和PLC13对具核梭杆菌的最低抑菌浓度分别为25ug/ml和12.5ug/ml,最低杀菌浓度分别为25ug/ml和12.5ug/ml。抗菌肽PJF11和PLC13对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为25ug/ml,最低杀菌浓度均为50ug/ml。2.抗菌肽PJF11和PLC13在100ug/ml时的溶血性分别为2.8%和6.9%,在50ug/ml时的溶血性分别为1.2%和1.9%,在25ug/ml及以下各组浓度中,两种抗菌肽无溶血作用。3.纸片扩散法结果显示抗菌肽PJF11和PLC13对具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性随着纸片药物浓度的降低而呈现缩小的趋势。药物浓度相近时,抗菌肽形成的抑菌圈明显小于氯己定漱口液形成的抑菌圈。第二章抗菌肽抗菌机制初探目的初步探讨抗菌肽PJF11和PLC13的抗菌机制。方法1.具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌培养至对数生长期后,将菌液与抗菌肽PJF11或PLC13混匀,并设不加药物的未处理组。在适宜的培养条件下反应60min后,离心收集菌体沉淀。经过漂洗、固定、脱水、置换、干燥等步骤后于扫描电镜下观察并拍照。2.具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌培养至对数生长期后,将菌液与不同浓度的抗菌肽PJF11或PLC13混匀,设不加药物的未处理组。在适宜的条件下培养后,加入碘化丙啶,于荧光显微镜下观察并拍照。3.细菌基因组DNA和总RNA分别以相应的试剂盒提取。将具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌培养至对数生长期,以试剂盒提取出细菌基因组DNA或总外灯下观察并拍照。结果RNA,然后与不同浓度的抗菌肽分别混匀作用后,于水平电泳仪上做电泳,紫1.扫描电镜结果显示经过抗菌肽PJF11和PLC13处理后的具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌,与未经肽处理的细菌相比,在形态学上发生了一些改变如细胞膜变粗糙,形态发生不规则变化等。2.荧光显微镜观察结果显示与未经肽处理的细菌相比,经过抗菌肽PJF11和PLC13处理后的具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌表现为随浓度增加,染色细菌量增多,细菌荧光强度随之增强。3.在两种细菌的基因组DNA结合实验中,不同浓度的抗菌肽,仅在100ug/ml时,可见条带亮度明显减弱,提示DNA部分被抗菌肽结合,因而被阻滞在加样孔附近。细菌总RNA结合实验结果显示,抗菌肽浓度从3ug/ml至100ug/ml,均未见对细菌总RNA的电泳造成影响,提示抗菌肽PJF11和PLC13在100ug/ml浓度范围内,对两种细菌的总RNA无结合作用。全文结论抗菌肽PJF11和PLC13对具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性,溶血性较低,发挥抗菌作用的机理可能是胞膜破坏机制,其具有在高浓度(100ug/ml)时结合细菌基因组DNA的能力,这一结果显示其没有通过结合细菌核酸发挥杀菌的作用。