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随着科学技术发展,对分子检测技术的特异性、灵敏度有着更高要求。尤其是在临床应用和基础研究中,分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此,探索新技术或改进现有技术以提高分子水平的精确定量,突破检测技术这一瓶颈,是目前科研工作的重中之重。
本研究目的是构建一个具有配体识别和信号扩增能力的检测分子。在核酸信标配基的研究中,利用指数级富集配基进化技术(SELEX)筛选到小鼠IgG 抗体 Fc片段的特异性寡核苷酸配基,并进行了克隆、测序、序列分析及采用多种方法进行特异性鉴定,如:利用PCR进行阳性克隆筛选,dot-blot 阳性配基筛选,高压液相色谱,凝胶阻滞等活性鉴定。共筛选到16株特异性配基克隆。同时,首次建立了一套较为完整的SELEX 硝酸纤维素滤膜快速筛选方法。在此基础上,发明了核酸信标配基,完成设计、合成及活性鉴定。核酸信标配基是通过巢式-PCR 方法,在配基的5 ’端连接一段荧光标记探针的靶(Beacon)序列,该序列是由两端两个引物和中间Taqman 探针的互补序列构成,和靶分子具有对应性,即双链核酸信息标记的核酸信标配基。由于核酸信标是双链,不影响配基和靶分子(Fc片段)的结合,因此通过核酸信标来完成信息传导和信号放大功能。本文首次利用琼脂糖凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮兰双显色方法,对核酸信标配基和抗体结合特异性进行鉴定。另外,本文首次建立两种方法对核酸信标配基进行功能鉴定:一种方法是核酸信标配基免疫-PCR 方法(NBA-iPCR),该方法是通过核酸信标配基与抗体结合形成信标配基-抗体复合物作为检测分子,再利用配基-抗体与抗原结合形成信标配基-抗体-抗原复合物,完成抗原信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR 检测证明,核酸信标配基具有传感和扩增能力。另一种方法是核酸信标配基-PCR 方法(NBA-PCR),该方法是将核酸信标配基作为检测分子,通过核酸信标配基和靶分子(抗体)结合形成配基-靶分子复合物,完成靶分子信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR 检测证明,核酸信标配基自身具有配基和配体识别能力和信号放大功能。综上所述:核酸信标配基完全具有适配体识别能力和信号储存、传递、放大功能。该分子将成为一种全新的、构建灵活、检测特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分子。