近年来，随着树突状细胞(dendritic cell，DC)体外诱导扩增技术的发展，DC用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究日趋增多，DC有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效手段。小儿恶性肿瘤如淋巴瘤、神经母细胞瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)等在临床上早期诊断较难，一般确诊时已属中晚期，常规的化疗和放疗作用有限，并伴有明显的毒、副作用，甚至影响生长发育，而且转移和复发的问题至今仍未解决，所以寻找一种高效、安全的治疗方法成为目前临床的迫切需要。 实验目的：本研究期望通过对恶性肿瘤患儿自体DC体外诱导扩增、DC成熟诱导和体外DC负载肿瘤抗原信息等方法进行一些安全性和技术性改进，观察自体外周血体外扩增的负载肿瘤抗原信息的DC(本实验中简称为肿瘤DC)的抗原提呈、刺激自体外周血T细胞增殖和体外抗肿瘤免疫功能，探讨其应用于临床前的安全性和有效性。 实验方法：1．选择小儿晚期恶性肿瘤病例，并获得其监护人的书面同意：2．通过活检获取肿瘤组织进行自体肿瘤细胞培养，并进行细胞第四军医大学硕士学位论文免疫组织化学鉴定;3.收集对数生长期的自体肿瘤细胞通过反复冻融和25Gy““co丫射线照射，制备用于致敏Dc的肿瘤全细胞抗原;4.取患儿外周血，用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁Zh，弃去未贴壁和贴壁不牢的细胞获得外周血单核细胞，体外用rhIL一4、thGM一CSF定向诱导单核细胞增殖分化成DC，并在培养第3天加入肿瘤全细胞抗原、第7天加入TN下一a诱导DC成熟，第9天收集肿瘤DC，计数并计算扩增效率，所有细胞培养均以同型人血清做为培养液添加剂:5.光镜、扫描和透射电子显微镜下观察肿瘤DC形态:6.间接免疫荧光法染色，流式细胞分析肿瘤DC表面CD la、Coso、Co86和HLA一DR的表达情况;7.收集患儿外周血T细胞，与肿瘤DC混合培养3d，MTT法显色，测OD值，计算T细胞刺激指数，做为代表肿瘤DC刺激T细胞增殖能力的指标;8.肿瘤DC(实验组)和肿瘤全细胞抗原(对照组)分别与患儿自体外周血T细胞共培养3d，以激活T细胞成为细胞毒性T细胞(CTL)，将CTL与自体肿瘤细胞按照效靶比为10:1混合培养24h，MTT法显色，计算杀伤率。 实验结果:1.12岁男性患儿，病理活检确诊为鼻咽癌，己有双侧颈部淋巴结转移并侵及右侧眼部，属鼻咽癌W期，监护人书面同意行此实验。2.患儿鼻咽癌肿瘤细胞原代培养和传代成功，细胞增殖迅速，平均3d传代一次，已传12代;细胞免疫组化结果与活检肿瘤组织相同。3.顺利制备到肿瘤全细胞抗原。4.患儿外周血通过淋巴细胞分离液密度梯度离心，平均获得的PBMc数量为(2 .3士0.5)xl护/mL;经过9天thIL一4、rhGM一CsF和TNF一a三种细胞因子组合诱导扩增，并用经过反复冻融和丫第4页第四军医大学硕士学位论文射线照射处理过的肿瘤全细胞抗原刺激，可以使单核细胞增殖并定向分化，最后每mL外周血收获的DC数量为(3 .2士1.1) x1OS个;DC扩增效率为1.4。5.光镜、扫描和透射电镜下观察到体外培养的细胞具有自发聚集、悬浮生长和树枝状突起等典型DC特征。6.肿瘤DC的细胞表面抗原CDla阳性率为0.78士0.11，HLA一DR阳性率0.86士0.08，CD80和CD86阳性率分别为0.78士0.13和0.67士0.14。7.肿瘤DC具备很强的刺激自体T细胞增殖的能力。在肿瘤DC二T细胞(即效靶比)=1:100时，T细胞的刺激指数(sI)达到了5.3月.1;而效靶比为1:5时则刺激作用更显著，51升高到23.6士3.4。8.T细胞:肿瘤细胞(即效靶比)=10:l时，经过肿瘤DC活化的自体CTL(DC一CTL)对于自体肿瘤细胞的杀伤率为(60.牡10.0)%，明显高于仅用肿瘤抗原体外致敏的CTL(Ag一CTL) (33.9士5.6)%，尸<0.05。 结论:本实验通过应用临床药物和同型人血清代替以往实验研究试剂，并采用反复冻融和射线照射的方法彻底灭活自体肿瘤细胞，增强了体外培养DC用于体内临床研究的安全性。用该方法从IOmL外周血获得的自体DC数量，就能满足临床治疗研究的需要;同时DC表面HLA一DR和共刺激分子CD80、CD86的高表达，提示本实验扩增的肿瘤DC为免疫功能健全的mDC。体外研究证实该肿瘤DC刺激T细胞增殖的能力很强，而且活化的T细胞具有很强的杀伤自体肿瘤细胞的活性。为研究小儿恶性肿瘤的DC免疫治疗，提供了体外实验依据，并做了必要的临床前准备。 主要创新点:1.首次进行了小儿鼻咽癌DC免疫治疗的临床前探索，并在DC的诱导扩增中使用临床药物和同型人血清代替实验试剂，这一改第5页第四军医大学硕士学位论文进提高了临床应用的安全性。2.以体外培养的患儿自体肿瘤细胞和自体外周血扩增的DC为研究对象，证明了该DC体外抗肿瘤的有效和高效性及临床应用的可行性。