腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是细小病毒科的一类无囊膜、具有二十面体结构、嗜性广泛的单链DNA病毒,作为高效安全的转基因载体,被广泛用于基因治疗、神经环路标记、活体成像、基因编辑以及神经系统疾病动物模型的制备等方面。尽管AAV应用广泛,但仍存在着对于特定组织细胞的转导能力差和穿透血脑屏障效果不佳等缺点。本文在系统地了解不同自然血清型AAV的嗜性基础上,基于定向进化及理性化设计的策略针对AAV的衣壳结构基因Cap设计突变文库,作为对文库筛选范式的验证,我们以“获得高效跨血脑屏障的AAV突变体”作为初步的筛选目标。首先,自然血清型的AAV是优化改造工作的基础,为了给后续的衣壳优化工作提供参照标准,我们分别包装了 13种自然血清型的AAV,并初步进行了细胞水平的感染特性探究,发现AAV6、AAV2、AAV1等血清型对多种细胞系均表现出较佳的感染效果,尤其是AAV6对神经胶质细胞系表现出更好的感染特性,这启示我们未来在靶向神经胶质细胞的AAV载体改造中,AAV6或可作为首选的模板血清型;其次,为了优化用于装载Cap基因文库进而制备AAV病毒文库的质粒系统,我们设计了 5种包装质粒方案,通过实验对比,发现pAAV-ITR-P41-lox Cap核心质粒配合Rep2-AAP辅助质粒的方案包装效果最优,因此将该方案用于后续突变体文库的包装;然后,基于定向进化和理性化设计的方法,兼顾文库丰度的同时,围绕“获得高效跨血脑屏障的AAV突变体”这一筛选目标有侧重地引入理性化因素以降低基因文库的冗余度,从而设计和制备Cap基因文库,并将Cap基因文库装载到先前验证的pAAV-ITR-P41-lox Cap核心质粒上,构建了基于DNA改组方法的pAAV-Shuffling质粒文库、基于多肽展示方法的pAAV-PD文库(约包含11810种突变体)和基于理性化设计的19种pAAV-ZH系列质粒;最后,将质粒文库和辅助质粒共转染HEK293T细胞系,包装获得了基于多肽展示方法AAV-PD病毒文库(3.14×1012 VG/ml)与19种AAV-ZH突变体,对比不同突变体的包装滴度,证实了在AAV衣壳中插入的外源肽段长度越长越不利于病毒粒子包装,在细胞水平评估实验中对神经胶质瘤细胞(U87)表现出感染性的ZH05、ZH06突变体或有进一步研究的价值。这些研究工作初步建立了基于DNA改组、多肽展示等成熟的定向进化技术构建AAV突变体文库的系统范式,制备了可用于后续筛选的AAV病毒文库和若干AAV突变体,为后续更进一步的突变体文库构建和广泛的突变体筛选奠定了初步的基础。