轮状病毒(rotavirus,RV)感染是引起婴幼儿重症腹泻最重要的因素之一,也是造成发展中国家儿童死亡的重要原因。在世界各国,90%以上的婴儿在3岁之前均受到了RV的感染,在5岁以下腹泻住院患儿中,RV感染病例占20%--70%,5岁以上的儿童几乎全都感染过RV。美国每年与轮状病毒感染有关的医疗费用高达3—10亿元,可见轮状病毒腹泻不仅影响了全球儿童的健康,而且造成严重的经济负担。有效的疫苗接种可以显著减少由RV引起的儿童重症腹泻,也是唯一可行的预防控制RV较高发病率和死亡率的方法[1-2]。轮状病毒颗粒由3层组成:外部衣壳、内部衣壳和核心。外部衣壳由VP7和VP4组成。VP7形成相对光滑的外表面,VP4组成钉状突起,二者都是中和抗原,可诱导机体产生中和抗体。VP4还在病毒感染过程中扮演重要的作用,作为一种细胞结合蛋白,VP4经胰酶切割后可增强轮状病毒对宿主的感染性。因此,以轮状病毒外壳蛋白基因VP4基因,将其重组到原核表达载体上,以研究病原基因在宿主菌中的表达情况,为新型口服疫苗的研究奠定基础[3-5]。目的:构建携带轮状病毒外壳蛋白VP4基因的重组质粒(即pBEX/VP4),检测重组质粒的表达,并对重组载体表达蛋白的安全性进行验证。方法:(1)根据Genbank中鼠源VP4的基因序列设计34对引物,通过重叠PCR合成VP4基因。以pGEX-5x-1为基础,构建穿梭表达载体pBEX,并将合成的VP4基因重组入pBEX,得到重组质粒pBEX/VP4。(2)将其转化大肠杆菌,SDS-PAGE验证蛋白的表达。通过肠袢实验验证表达蛋白的安全性。结果:(1)测序表明,合成的VP4基因正确,并成功构建了穿梭载体pBEX/VP4。(2)VP4蛋白在大肠杆菌中成功表达,其表达蛋白经肠袢实验证实是无毒的。结论:(1)在没有模板的情况下,重叠PCR法可以用来合成目的基因;(2)VP4蛋白在大肠杆菌中的表达,说明穿梭载体的构建是成功的,而肠袢实验验证了表达蛋白的安全性,为以后将重组穿梭载体转入宿主菌,作为新型口服疫苗的研究奠定了基础。