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在哺乳动物胚胎发育过程中,胚胎细胞第一次分化形成内细胞团和滋养外胚层。滋养层干细胞(trophoblast stem cells, TSC)是胎盘细胞的前体细胞,在胎盘发育中有重要作用。有蹄类滋养层干细胞的建系是公认的难点,目前仅在山羊、牛、猪等有蹄类动物获得滋养层细胞的报道,但这些研究并没有对这些细胞系多潜能性或干细胞的特征进行全面鉴定。因此这些细胞系可能处于有别于TSC的分化阶段。本研究比较了不同培养体系对牛类滋养层干细胞(bovine trophoblast stem-like, bTS)建系的影响,特别对利用2i(PD0325901和CHIR99021)获得的牛类滋养层干细胞bTS进行了鉴定,包括碱性磷酸酶检测、核型分析、干细胞多能性标志物基因表达情况和分化潜能的检测,以确定bTS是否为典型的牛类滋养层干细胞。我们采用寡聚核苷酸芯片检测了约23000个牛的转录物,还分别对干细胞多潜能性转录因子OCT4、NANOG、SOX2、CDX2基因的启动子区域甲基化情况进行了初步分析。主要研究成果如下：1不同的培养体系对牛类滋养层干细胞培养和建系的影响以DMEM/F12+Neurobasal Medium+N2B27或单独使用DMEM/F12作为基础培养液,添加2i、FGF或Wnt3a,分别以L Wnt-3A/MEF混合细胞或BFF作为饲养层,探讨不同的培养体系对牛滋养层干细胞培养和建系的影响。结果表明：2i培养液结合L Wnt-3A/MEF和添加Wnt3a的2i培养液结合BFF两个培养体系中培养的bTS具有典型的类似小鼠TSC的形态,呈单层扁平生长,体外长期培养没有明显的形态变化,所建的细胞系最长己传至170代；而在去除小分子PD0325901并添加FGF的培养体系,无论使用L Wnt-3A/MEF或BFF作为饲养层,细胞生长缓慢,虽然形态类似小鼠ESC,呈三维立体生长,但均未能传过18代。2bTS细胞系滋养层干细胞基本特性的鉴定本研究利用2i培养液结合L Wnt-3A/MEF所建立的细胞系BTS-1具有正常的二倍体核型。在体外长期培养中,该细胞系保持了未分化状态,碱性磷酸酶检测呈阳性,表达干细胞多能基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81、 SSEA-1和SSEA-4。同时表达TSC标志基因CDX2、TEAD4、EOMES、ELF5、 GATA3、SMARCA4(BRG1)、ETS2和ERR2。bTS细胞体外可分化为类胚体或贴壁生长并形成双核滋养层细胞。分化的细胞中检测到滋养层分化标志物HAND1、 MASH2和PL-1表达上调。在畸胎瘤实验中,bTS细胞能在NOD-SCID小鼠体内产生胎盘滋养层细胞。我们认为bTS细胞具有滋养层干细胞的基本特征。此外,BTS-1细胞经GFP慢病毒转染并被DOX诱导后,14.81%的细胞能够表达GFP。3bTS细胞系的基因表达寡聚核苷酸芯片分析和甲基化分析在BTS-1中,有一些多潜能性基因表达水平低于其在囊胚中的表达水平,但高于它们在BFF中的表达水平,这一类基因包括OCT4、SOX2、GDF3、KLF4、 KLF5、SFRP2、SMAD3、SPARC、STAT3、TBX3和THAP11;在BTS-1细胞和囊胚中,TDGF、MYCN、CCR4、ALPL、SMAD2和SUZl2的表达水平相近,但它们在BTS-1的表达明显高于BFF细胞；TFAP2A、ELF5、CYP11A1、PPARG、 ID2、GCM1、HAND1和THAP11等TSC基因和TR基因在BTS-1细胞中表达很高；牛TR标志物基因,例如TDK和PAG,在BTS-1细胞中有很强的表达。对4种干细胞关键基因的甲基化分析结果显示：与囊胚相比,BTS-1细胞中OCT4.NANOG和SOX2的甲基化程度分别升高168%(P<0.001)、120%(P<0.05)和116%(P﹤0.001)。CDX2发生了甲基化,但2个启动子区域甲基化程度与囊胚相比分别降低27%(P<0.5)和57.7%(P<0.001)。与BFF细胞相比,BTS-1细胞中NANOG和SOX2的甲基化程度分别上升179.20%(P<0.001)和57.14%(P﹤0.25), CDX2的2个启动子区域甲基化程度分别上升36.36%(P<0.005)和136.36%(P<0.4),而OCT4下降42.24%(P<0.001)。综合上述研究结果可见：通过2i抑制MEK和GSK3通路,同时使用能分泌Wnt3a的L Wnt-3A细胞作为饲养层或直接在培养液中加入Wnt3a,可能是牛类滋养层干细胞培养和建系的必须条件。